Indurre radici pelose di Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

Il grano saraceno tartario (TB)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) è un tipo di dicoledone appartenente al genere Fagopyrum e alla famiglia Polygonaceae¹. Come tipo di cibo omologato medicina levato, la TB ha ricevuto un notevole interesse a causa della sua composizione chimica distintiva e delle diverse bioattività contro le malattie. La tubercolosi è principalmente ricca di carboidrati, proteine, vitamine e carotenoidi, nonché in polifenoli come fenolici e flavonoidi¹. Varie attività biologiche e farmacologiche dei flavonoidi, tra cui antiossidanti, antiipertensive²e anti-infiammatori e proprietà antitumorali e antidiabetici, sono state dimostrate³.

Agrobacterium rhizogenes è un batterio del suolo che contribuisce allo sviluppo di malattie delle radici pelose in diverse piante superiori, in particolare dicotiledoni, infettando i siti delle ferite^4,5. Questo processo è iniziato dal trasferimento del DNA T nel plasmide che induce la radice (Ri)^5,6 ed è comunemente accompagnato dall’integrazione e dall’espressione di un gene esogeno dal Ri plasmide e dalle successive fasi di generazione del fenotipo della radice pelosa⁷. A. le radici pelose transgeniche mediate da rizogeni,come potente strumento nel campo della biotecnologia vegetale, sono state ampiamente utilizzate a causa della loro produttività stabile e elevata e del facile ottenimento in un breve periodo. Inoltre, le radici pelose indotte da A. rhizogenes si distinguono in modo efficiente per il loro sviluppo di radici plagiotropiche e la crescita altamente ramificata in un mezzo privo di ormoni⁸. Possono essere utilizzati in diversi campi di ricerca, tra cui la produzione di semi artificiali, la ricerca sul nodulo delle radici, e nello studio delle interazioni con altri organismi come i funghi micorrizaci, i nematodi e i patogeni delle radici^7,9. Inoltre, le colture di trasformazione delle radici pelose sono state ampiamente utilizzate come sistema sperimentale per studiare i percorsi biochimici e la segnalazione chimica e per produrre metaboliti secondari vegetali che vengono utilizzati come prodotti farmaceutici, cosmetici e additivi alimentari^8,10. I preziosi metaboliti secondari, tra cui alcaloidi indole, aconiti, alcaloidi del tropane, terpenoidi e flavonoidi, sintetizzati in radici pelose di tipo selvatico sono stati studiati per diversi decenni in numerose specie, come il ginsenoside^,de Panax ginseng¹¹, coumarine in Ammi majus¹², e i composti fenolici in²³.¹³

Le radici pelose sono state prodotte utilizzando A. rhizogenes in 79 specie vegetali di 27 famiglie¹⁴. Per esempio, A. rizogenes-mediato trasformazione della radice pelosa mediata è stato segnalato nella soia^15,16, Salvia¹⁷, Plumbago indica¹⁸, Lotus japonicus¹⁹, e cicoria (Cichorium intybus L.) ²⁰. Tb trasformazione della radice pelosa è stato studiato anche². Sono disponibili pochi protocolli dettagliati per quanto riguarda lo sviluppo di radici pelose mediate da A. rhizogenes che trasportano o meno un vettore binario. Per esempio, Sandra et al.²¹ ha introdotto un metodo per produrre radici pelose di patate transgeniche sostenute nei germogli di tipo selvatico. Le radici pelose completamente sviluppate potrebbero essere visualizzate 5-6 settimane dopo l’iniezione di A. rizogeni che trasportavano il gene del gus reporter negli internodi delle piante di patate. Un altro studio aveva anche riportato un sistema di radici pelose transgeniche indotto da A. rhizogenes che ospita il gene di reporter gusA in iuta (Corchorus capsularis L.) ²². Inoltre, Supaart et al.²³ ha ottenuto radici pelose di tabacco transgenico utilizzando A. rhizogenes trasformati con il vettore di espressione pBI121 portando il gene di sintetizzatori di acido¹-tetraidrocancandeinolicosco (THCA) per produrre THCA.

Tuttavia, un processo passo-passo per una generazione efficace di trasformazione della radice pelosa, soprattutto nella TB, è stato relativamente meno dimostrato. In questo studio, abbiamo descritto un protocollo dettagliato utilizzando A. rhizogenes che trasporta il gene reporter (GFP), un marcatore selettivo (Kan) e un gene di interesse (b4, un gene identificato dal nostro gruppo ma inedito dalla famiglia di base elicoidale-loop-elica(bHLH) per generare la trasformazione genetica della radice pelosa nella TB. L’esperimento durò 5-6 settimane, dall’inoculazione dei semi alla generazione di radici pelose, coinvolgendo la preparazione dell’espianto, l’infezione, la cocultura, la subcultura e la successiva propagazione. Inoltre, A. rhizogenes contenente un plasmid binario che trasporta la transgene TB del fattore di trascrizione della mieloblastosi 116 (FtMYB116) è stato utilizzato per determinare se il FtMYB116 può promuovere l’accumulo di flavonoidi, in particolare rutina, nella TB a livello genico e metabolico attraverso la trasformazione della radice pelosa della TB. FtMYB116, che è un fattore trascrizionale indotta dalla luce, regola la sintesi della rutina in diverse condizioni di luce⁵. Chalcone synthase (CHS), flavanone-3-idxylase (F3H), flavonoide-3′-hydroxylase (F3‘H), e flavonol synthase (FLS)²⁴ sono enzimi chiave coinvolti nel percorso metabolico della biosintesi della rutina. Pertanto, questo studio dimostra la sovraespressione di FtMYB116 nelle radici pelose della TB e l’espressione dei geni enzimatici chiave, nonché il contenuto di rutina e altri flavonoidi come la quercetina.