מטרת פרוטוקול זה היא להעריך אם ניסוחים מלאכותיים שונים של קרע יכולים להגן על תאי אפיתל הקרנית האנושיים מפני התייבשות באמצעות מודל במבחנה. לאחר חשיפה לניסוחים מלאכותיים של קרעים והתייבשות, תאי אפיתל הקרנית האנושיים מוערכים לפעילות מטבולית.
ניסוחים מלאכותיים המכילים שומנים בדמעות מפותחים כדי להפחית את אידוי הדמעות על ידי שחזור של שכבת שומנים דמעה לקויה. ניסוחים מלאכותיים של קרע המונעים ייבוש תאים יגרמו להגנה על פני העין ולשמירה על פעילות מטבולית של התא. במהלך התייבשות, תאים עוברים את התהליך של אובדן פעילות מטבולית ולאחר מכן מוות של תאים. עבודה זו מתארת שיטה להערכת היעילות של ניסוחים דמעה מלאכותית. הצבע המטבולי (כלומר, alamarBlue) משתנה ממולקולה פלואורסצנטית נמוכה resazurin למולקולה פלואורסצנטית resorufin בתאים קיימא. הביצועים הביולוגיים של ניסוח קרע מלאכותי נמדדים כיכולת הניסוח (א) לשמור על הכדאיות של התא ו-(ב) לספק הגנה על התאים מפני התייבשות. מדיית צמיחה ותמיסת מלח משמשים כפקדים לבדיקות הכדאיות/התייבשות של התאים. תאים הם דגירה עם פתרונות בדיקה במשך 30 דקות ולאחר מכן מיובש במשך 0 או 5 דקות ב 37 °C (69 °F) ו 45% לחות יחסית. פעילות מטבולית של התא לאחר החשיפה הראשונית ולאחר ייבוש התא נקבעת לאחר מכן. התוצאות מראות את ההשפעות ההשוואתיות של ניסוחים טיפת עיניים על פעילות מטבולית התא והגנה על התייבשות. שיטה זו יכולה לשמש לבדיקת ניסוחים עיניים יבשות שנועדו לטפל באנשים עם עין יבשה אידוי.
מרכיבים רבים ושונים בפתרונות עיניים במינון מרובה נדרשים כדי לשמור על יציבות, pH, osmolarity, ויעילות. עם זאת, כמה כימיקלים כגון חומרים משמרים או פעילי שטח בתמיסות עיניים יכול לגרום נזק אפיתל הקרנית1,2. בדיקות הכדאיות של התא באמצעות תאי אפיתל הקרנית האנושיים (HCEC) ניתן לבצע כדי להעריך את הנזק הפוטנציאלי שנגרם על ידי מרכיבים שונים אלה ניסוחים עיניים. אחת מן מבחני במבחנה כי הוא שימושי במיוחד להערכת נזק לתאים הוא alamarBlue assay3. ב בדיקה זו, הצבע המטבולי (כלומר, alamarBlue) מכיל resazurin, אשר מתפקד כמחוון הכדאיות של התא. במהלך הנשימה התאית, resazurin מצטמצם resorufin על ידי קבלת אלקטרונים4. הפחתת resorufin גורם לשינוי ממולקולה שאינה פלואורסצנטית למולקולה פלואורסצנטית שניתן לזהות באמצעות ספקטרופלואורומטר5.
חקירה זו משתמשת בשני טיפולים שונים של תאי אפיתל הקרנית כדי לקבוע כיצד מוצרי עיניים יבשות עשויים לבצע במודל במבחנה. בהערכה הראשונה, התאים מטופלים עם מוצרים אלה במשך 30 דקות. לאחר הטיפול, התאים מוערכים לאחר מכן לפעילות מטבולית מיד לאחר החשיפה למוצרי העין היבשה ולאחר מרווח זמן התאוששות. הערכה זו קובעת את ההשפעה של מוצרים אלה על תאים לפני התייבשות בתא לחות. חומרים משמרים פתרון, פעילי שטח או מאגרים בפתרונות אלה עשויים להיות כמה השפעות ציטוטוקסיות על התאים שניתן לזהות באמצעות צבע מטבולי.
ההערכה השנייה קובעת את הפעילות המטבולית של התאים לאחר חשיפה למוצרי העין היבשה והתייבשות. בהערכה זו, אם הטיפול במוצר מציע הגנה לתאים מפני נזקי התייבשות, הפעילות המטבולית של התאים תישמר. הגנה על תאים מפני ההשפעות המזיקות של התייבשות עלולה להתרחש אם מוצר העין היבשה יכול לציפוי התאים עם שומנים או המוצר עלול לספוג נוזלים מהסביבה הוספת לחות לתאים.
פרוטוקול זה נועד לדמות תנאים חמורים של לחץ סביבתי על תאים. מחקרים אחרים השתמשו במודלים שונים כדי ליצור מתח חיצוני זה. מספר מחקרים ייבשו את התאים במכסה המנוע של זרימהלמינארית 6,7,8, ואילו אחרים השתמשו בטמפרטורת החדר ובלחות יחסית שונים (RH) ערכים9,10,11. שיטה של הדמיית תנאי עיניים יבשים היא להגדיל את osmolarity של פתרון הדגירה12,13. שיטה נוספת במבחנה להדמיית תנאים סביבתיים קשים היא להוסיף ציטוקינים למדיית התא כדי לדמות את נוזל הדמעות של חולי עיניים יבשות14. למרות בדיקות אלה הם מודלים מעניינים שיכולים להעריך כיצד כימיקלים להפחית מתח אוסמוטי או לעורר את המערכת החיסונית, מודלים אלה אינם מראים ישירות כיצד ניסוחים כימיים יכולים להגן על התאים מפני מתח התייבשות.
מודל התייבשות משתמש בתא טמפרטורה / לחות 37 °C (77 °F) ו 45% RH. הוא מדמה תנאים סביבתיים שיכולים לגרום לאידוי מפני השטח העין. סימולציות של תנאי סביבה קיצוניים אחרים כגון לחות נמוכה נמצא בתאי מטוסים15 או בסביבות מקורה בחודשי החורף16 יכול להתבצע גם בשיטה זו.
דוגמנות תרבות התא משמשת כדי לדמות את ההשפעה של לחץ ייבוש על הקרנית האנושית. על מנת לזהות מתח התא, בדיקות הכדאיות של התא מתבצעת כדי לקבוע את ההשפעה על בריאות התא. מספר בדיקות פיזיולוגיות שונות יכולות להתבצע על תאים כדי לקבוע אם הם לחוצים17. הניתוח המבוצע בהליך בדיקה זה משתמש בצבע המטבולי הזמין מסחרית (טבלת החומרים). יש לו את היתרון על פני בדיקות מתח תאים רבים אחרים בכך שהוא לא רעיל, מסיס במדיית צמיחה והוא יכול להעריך תאים ללא קיבעון התא18. בהליך זה התאים נבדקים לפעילות מטבולית מיד לאחר כל טיפול וקבוצה שנייה של תאים ממוקמים בחזרה לתוך מדיה צמיחה מוערך לאחר 18 שעות התאוששות. הסיבה לבדיקה מיד ולאחר מכן לאחר תקופת ההחלמה היא לזהות נזק לתאים שגורם להשפעות מיידיות על פעילות מטבולית ונזק לתאים שגורם להשפעות מעוכבות. כמו כן, הוא מספק הזדמנות להעריך את ההשפעה של ניסוחים אלה על נזק לטווח קצר לעומת לטווח ארוך ואת היכולת של ניסוחים להתאושש / לא להתאושש העלבון הראשוני.
חקירה זו משמשת להשוואת מוצרים שונים המכילים שומנים בעין יבשה להשפעתם על פעילות מטבולית HCEC עם וללא התייבשות. המרכיבים במוצרי העין היבשה שנבדקו מתוארים בטבלת החומרים. המרכיבים בתמיסה #1 הם נתרן קרבוקסימתילקולוז (0.5%), גליצרין (1 #2%) ושמן מינרלי (4.5%), ובתמיסה #3 השומנים הוא שמן מינרלי פרופילן גליקול הוא demulcent. שומנים אלה הם מרכיבי הניסוח שצפויים לספק הגנה על HCEC מפני התייבשות.
פרוטוקול זה נועד לקבוע את ההשפעות המגנות של פתרונות קרע מלאכותיים נגד התייבשות התא. בתחילה, התאים נחשפים לטיפות העיניים היבשות כדי לצפות את התאים. לאחר מכן, התאים מיובשים, ואת הפעילות המטבולית מנוטר כדי להעריך אם ניסוחים יכול להקל על ההשפעות המזיקות של מתח התייבשות. צעדים אלה הם קריטיים להבנת ההשפעה הכוללת של ניסוחים עיניים יבשות יכול להיות על הכדאיות הכוללת של תאי אפיתל הקרנית.
לאחר שרוב ניסוחי העין היבשה מוסרים מבארות התרבות, הכימיה של המולקולות הנותרות שנמצאות במגע עם התאים תשפיע על ייבוש התאים. מוצרים מסוימים מכילים מיקרו אמולסיות של שמנים הממזערים את אידוי התאים20. מחקר שהעריך ניתוח חיכוך לאחר השטיפה הראה תחזוקה של חיכוך נמוך עבור כמה ניסוחים עיניים יבשות אשר עשוי להיות אינדיקטור של זמן מגורים משופר של ניסוחים עיניים יבשות21. אחת המגבלות של מבחנה זו היא שלמרות שניתן להעריך הגנה מיובשת בהשוואה לניסוחים אחרים של טיפת עיניים, לא ניתן לקבוע את משך ההגנה הזו בשל זמן הייבוש הקצר המוערך. זמני ייבוש ארוכים יותר במבחנה זו עשויים לדרוש שימוש בתרבויות רב שכבתיות שיש להן בסך הכל יותר תכולת לחות מאשר מונולאייר של תאים.
ייתכן שיהיה צורך להתאים את זמני הדגירה הספציפיים עבור הניסוחים בתאים ואת משך זמן הייבוש אם ערכי הטמפרטורה והלחות משתנים. בחירת טמפרטורה, RH וזרימת אוויר עבור הדמיית תנאי מתח סביבתי שיכולים לתרום לעין יבשה יכול להיות קשה כמו התנאים הסביבתיים העונתיים והמקומיים הם משתנים למדי21. תאי סביבה מודרניים למחקרים בבני אדם יכולים לשנות את הטמפרטורה בין 5 °C (70 °F) ו 35 °C (60 °F), ו RH בין 5% ו 95%22. באמצעות אידוי ומשתפי מגן מצוידים היטב נקבע כי ב RH של 40-45% שיעור האידוי מהקרנית היה 0.037 μL / cm2/ min וב RH של 20-25% שיעור האידוי היה 0.065 μL / cm2/ min23. אם מודל במבחנה מסתכל על ההשפעה המגנה של ניסוחים בתנאי RH נמוכים מאוד כגון במטוסים15, מדבריות, או סביבות מקורה יבשות16, ייתכן שיהיה צורך להפחית את זמני הדגירה כדי להתאים את שיעורי האידוי המשופרים מהתאים. בנוזל הדמעות האנושי, קיימים מגוון שומנים שמקורם במיבומיה ובלוטות אחרות המגנות על הדמעות מפני אידוי. שומנים אלה יש נקודות התכה שונות24. שינויי טמפרטורה יכולים להשפיע על הנזילות של נוזל הדמעות כך שבדיקות המבוצעות בטמפרטורת הסביבה יכולות להיות שונות באופן משמעותי מבדיקות שנערכו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מאז טווח טמפרטורת פני העין הממוצע הוא מ 32.9 כדי 36 °C25, ביצוע הבדיקה ליד טווח טמפרטורה זה מומלץ.
בנוסף לצבע המטבולי (alamarBlue) המשמש בפרוטוקול זה, ישנם ריאגנטים כימיים אחרים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את ההשפעות של ניסוחים המוצר על פעילות מטבולית של התא. מלחי טטרזוליום (MTT, XTT, MTS, WST) הם כימיקלים חלופיים שניתן להשתמש בהם. ההבדל במלחי הטטרזוליום הוא ש- MTT היא מולקולה טעונה באופן חיובי כך שהיא יכולה להיכנס לציטופלסמה של תאיםחיים 26. MTT הופך בלתי מסיס לאחר הפחתתו על ידי NAD(P)H27. זה חייב להיות solubilized לפני קריאת ספיגה על קורא צלחת. שאר מלחי הטטרזוליום טעונים באופן שלילי28. הם חייבים להיות מופחתים על ידי מולקולות משניות מחוץ לתא החי כי הם לא יכולים להיכנס לתא ולקיים אינטראקציה ישירה עם מולקולות תאיים29. עבור XTT, MTS, ו WST-1 מבחנים, התוספת של סוכן צימוד אלקטרונים 1-methoxy phenazine methosulfate (PMS) יכול לשפר את הביצועים של מבחני30. בניגוד למבחנים המטבוליים המשתמשים במלחי טטרזוליום, alamarBlue אינו דורש סוכני צימוד סולוביליזציה או אלקטרונים נוספים. כמו כן, שלא כמו XTT, MTS או WST-1, alamarBlue חודר קרום התא והוא יכול להיות מופחת ישירות על ידי אנזימים הסלולר27,29. השוואה ישירה של alamarBlue למלחי tetrazolium הראו כי alamarBlue רגיש יותר להערכת הפעילות המטבולית של קווי תאים שונים כולל HCEC3,27,31,32.
נקודות קצה ביוכימיות אחרות יכולות להיחשב גם להערכת ההגנה על תאי אפיתל הקרנית האנושיים על ידי התייבשות. צבעים פלואורסצנטיים יכולים לשמש כדי לזהות חדירות קרום התא ופעילות אסטראז התא1. כמו כן, אפופטוזיס יכול להיות מזוהה על ידי כתמים עבור סמנים אפופטוטיים על פני התא או על ידי מדידה עבור פעילות caspase1,33. מבחנים אחרים קבעו את ההשפעות של מוצרים אופטלמולוגיים על צמתים הדוקים HCEC34. מבחנים אלה יכולים להיות משולבים בהערכות עתידיות תוך שימוש בהליכי הייבוש המתוארים במאמר זה.
ישנם גורמים רבים של עין יבשה. עין יבשה יכולה להיגרם על ידי הפרשת ירידה של דמעות, דלקת פני העין מוגברת או התייבשות מוגברת על פני העין. עבור אנשים שיש להם אידוי שימוש בעין יבשה טיפה המונעת התאים שלהם להתייבש במהלך תנאי ייבוש עשוי להקל על הסימפטומים של עין יבשה. אחת הבעיות בכמה ניסוחים עיניים יבשות היא נוכחות של חומרים משמרים שעלולים לפגוע במשטח העין. פגיעה בתאים אינה מועילה לחולי עיניים יבשים מכיוון שהיא יכולה לגרום ליותר תאים למות מכיוון שתאים פצועים רגישים יותר ללחץ ייבוש35.
מאמר סקירה שנערך לאחרונה על ידי Garrigue et al.36 מספק הערכה של הידע הנוכחי של איך מוצרים מבוססי שומנים פועלים כדי להקל על עין יבשה אידוי. הוספת שומנים לדמעות חסרות שומנים יכולה למנוע אידוי, ובכך להגן על התאים מפני התייבשות. בנוסף, humectants הם מולקולות למשוך ולשמור על מים על פני השטח העין37. גם גליצרין בתמיסה #1 וגם פרופילן גליקול בתמיסה #3 הם humectants. פתרון #3 הראה השפעה הגנתית גדולה יותר של HCEC שאולי היה בשל תכונות השומנים ולחות של מרכיבי הניסוח.
פרוטוקול זה נועד להעריך את הפעילות המטבולית של HCEC לאחר חשיפה לניסוחים של העין היבשה וללחץ ייבוש. באמצעות השיטות המתוארות במאמר זה, ניתן לפתח טיפות עיניים חדשות שאינן מרגיזות ומגוננות עבור אנשים הסובלים מעין יבשה מתאדה.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לאלקון על מתן תמיכה כספית למחקרים אלה.
75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand collagen coated |
96 well plate | costar | 3370 | |
alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand collagen coated |
Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 – 700 nm (for assay 540/590) |
DMEM/F12 with L-glutamine and 15 mM HEPES | Gibco | 11039-021 | There is No Phenol Red in this media |
Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169–72. |
Humidity/Temperature Chamber | Associated Environmental Systems | LH-1.5 | Economy Line Humidity Chamber |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100X concentration so add 1ml to each 99ml of media |
Refresh Optive Advanced (solution #1) | Allergan, Inc | Carboxymethylcellulose Sodium (0.5%),Glycerin (1%),polysorbate 80 (0.5%),-Lubricants- Inactive ingredients-boric acid; carbomer copolymer type A; castor oil; erythritol; levocarnitine; purified water; Purite (stablized oxychloro complex)and may contain sodium hydroxide to adjust pH. | |
Soothe XP (solution #2) | Bausch & Lomb | Light mineral oil (1.0%), Mineral Oil (4.5%)-emolients-Inactive ingredients-boric acid, edetate disodium, octoxynol-40, polyquaternium-1 (preservative), polysorbate 80, purified water, sodium borate decahydrate. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide (to adjust pH). | |
Systane Complete (solution #3) | Alcon Inc. | Propylene Glycol 0.6% Lubricant Inactive ingredients- boric acid, dimyristoyl phosphatidylglycerol, edatate disodium, hydroxypropyl guar, mineral oil, polyoxl 40 stearate, POLYQUAD® (polyquaternium-1) 0.001% preservative, sorbitan tristearate, sorbitol and purified water. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide to adjust pH. | |
TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |