JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Médecine

Effect van kunstmatige traanformuleringen op de metabolische activiteit van menselijke cornea-epitheelcellen na blootstelling aan uitdroging

Published: May 02, 2020
doi:
10.3791/60812
, , , , , , , ,
1Alcon Vision, LLC, 2Centre for Ocular Research and Education (CORE), School of Optometry & Vision Science,University of Waterloo

Summary

Het doel van dit protocol is om te evalueren of verschillende kunstmatige traanformuleringen menselijke hoornvliesepitheelcellen kunnen beschermen tegen uitdroging met behulp van een in vitro model. Na blootstelling aan kunstmatige traanformuleringen en uitdroging worden menselijke hoornvliesepitheelcellen beoordeeld op metabole activiteit.

Abstract

Kunstmatige lipide-bevattende scheurformuleringen zijn ontwikkeld om traanverdamping te verminderen door het herstel van een gebrekkige traanlipidelaag. Kunstmatige traanformuleringen die celuitdroging voorkomen, zullen resulteren in oogoppervlakbescherming en het behoud van celmeboolactiviteit. Tijdens uitdroging ondergaan cellen het proces van verlies van metabole activiteit en vervolgens celdood. Dit werk beschrijft een methode voor het beoordelen van de werkzaamheid van kunstmatige traanformuleringen. De metabolische kleurstof (d.w.z. alamarBlue) verandert van een laag fluorescerend molecuul resazurin naar een fluorescerend molecuul resorufine in levensvatbare cellen. De biologische prestaties van een kunstmatige scheurformulering worden gemeten als het vermogen van de formulering om (a) de levensvatbaarheid van de cel te behouden en (b) celbescherming tegen uitdroging te bieden. Groeimedia en zoutoplossing worden gebruikt als controles voor de cel levensvatbaarheids-/uitdrogingstests. Cellen worden gedurende 30 minuten geïncubeerd met testoplossingen en vervolgens 0 of 5 minuten uitgedroogd bij 37 °C en 45% relatieve vochtigheid. Cel metabole activiteit na de eerste blootstelling en na celdroging wordt dan bepaald. De resultaten tonen de vergelijkende effecten van oogdruppelformuleringen op de metabolische activiteit van cellen en uitdrogingsbescherming. Deze methode kan worden gebruikt om droge ogen formuleringen te testen die zijn ontworpen om personen met verdampingsdroog oog te behandelen.

Introduction

Veel verschillende ingrediënten in oogheelkundige oplossingen met meerdere doses zijn nodig om stabiliteit, pH, osmolariteit en werkzaamheid te behouden. Sommige chemicaliën zoals conserveermiddelen of oppervlakteactieve stoffen in oculaire oplossingen kunnen echter schade aan het hoornvliesepitheel veroorzaken1,2. Cel levensvatbaarheidstests met behulp van menselijke hoornvliesepitheelcellen (HCEC) kunnen worden uitgevoerd om de potentiële schade te beoordelen die door deze verschillende ingrediënten in oftalmische formuleringen wordt veroorzaakt. Een van de in vitro assays die bijzonder nuttig is voor het beoordelen van celschade is de alamarBlue assay3. In deze test bevat de metabolische kleurstof (d.w.z. alamarBlue) resazurin, die fungeert als een indicator voor de levensvatbaarheid van cellen. Tijdens cellulaire ademhaling wordt resazurin gereduceerd tot resorufine door elektronen te accepteren4. De reductie van resorufine veroorzaakt een verandering van een niet-fluorescerend molecuul naar een fluorescerend molecuul dat kan worden gedetecteerd met behulp van een spectrofluorometer5.

Dit onderzoek maakt gebruik van twee verschillende behandelingen van de cornea-epitheelcellen om te bepalen hoe droge ogenproducten kunnen presteren in een in vitro model. In de eerste evaluatie worden de cellen gedurende 30 minuten met deze producten behandeld. Na de behandeling worden de cellen onmiddellijk na blootstelling aan de droge ogen en na een hersteltijdinterval geëvalueerd op metabolische activiteit. Deze beoordeling bepaalt het effect van deze producten op cellen voorafgaand aan uitdroging in een vochtigheidskamer. Oplossingsconserveringsmiddelen, oppervlakteactieve stoffen of buffers in deze oplossingen kunnen enkele cytotoxische effecten hebben op de cellen die kunnen worden gedetecteerd met behulp van de metabolische kleurstof.

De tweede evaluatie bepaalt de metabolische activiteit van de cellen na blootstelling aan de droge ogen en uitdroging. In deze beoordeling, als de productbehandeling bescherming biedt aan de cellen tegen uitdrogingsschade, zal de metabolische activiteit van de cellen worden gehandhaafd. Celbescherming tegen de schadelijke effecten van uitdroging kan optreden als het droge oogproduct de cellen kan bedekken met lipiden of als het product vloeistof uit de omgeving kan absorberen en vocht aan de cellen kan toevoegen.

Dit protocol is ontworpen om ernstige omstandigheden van omgevingsstress op cellen te simuleren. Andere studies hebben verschillende modellen gebruikt om deze externe stress te creëren. Sommige studies hebben de cellen gedroogd in laminaire stromingskappen6,7,8 , terwijl anderenkamertemperatuuren verschillende relatieve vochtigheidswaarden (RH) hebben gebruikt9,10,11. Een methode voor het simuleren van droge ogen is het verhogen van de osmolariteit van de incubatieoplossing12,13. Een andere in vitro methode voor het simuleren van ongunstige omgevingsomstandigheden is het toevoegen van cytokinen aan de celmedia om de traanvloeistof van droge oogpatiënten te simuleren14. Hoewel deze tests interessante modellen zijn die kunnen evalueren hoe chemicaliën osmotische stress verminderen of het immuunsysteem stimuleren, laten deze modellen niet direct zien hoe chemische formuleringen cellen kunnen beschermen tegen uitdrogingsstress.

Het uitdrogingsmodel maakt gebruik van een temperatuur/vochtigheidskamer van 37 °C en 45% RV. Het simuleert omgevingsomstandigheden die verdamping van het oculaire oppervlak kunnen veroorzaken. Simulaties van andere extreme omgevingsomstandigheden zoals de lage luchtvochtigheid in vliegtuigcabines15 of in binnenomgevingen tijdens de wintermaanden16 kunnen ook met deze methode worden uitgevoerd.

Celkweekmodellering wordt gebruikt om het effect van uitdrogingsstress op het menselijk hoornvlies te simuleren. Om celstress op te sporen, worden cel levensvatbaarheidstests uitgevoerd om de impact op de celgezondheid te bepalen. Verschillende fysiologische tests kunnen worden uitgevoerd op cellen om te bepalen of ze gestrest zijn17. De analyse die in deze testprocedure wordt uitgevoerd, maakt gebruik van de in de handel verkrijgde metabolische kleurstof (Tabel met materialen). Het heeft het voordeel ten opzichte van vele andere celstresstests in die omdat het niet-toxisch is, oplosbaar in groeimedia en cellen kan evalueren zonder celfixatie18. In deze procedure worden de cellen onmiddellijk na elke behandeling getest op metabole activiteit en wordt een tweede set cellen terug in groeimedia geplaatst en na 18 uur herstel geëvalueerd. De reden voor het testen onmiddellijk en dan na een herstelperiode is om celschade te identificeren die onmiddellijke effecten op metabole activiteit en celschade veroorzaakt die vertraagde effecten veroorzaakt. Het biedt ook de mogelijkheid om de impact van deze formuleringen op schade op korte of lange termijn te evalueren en het vermogen van de formuleringen om te herstellen / niet te herstellen van de eerste belediging.

Dit onderzoek wordt gebruikt om verschillende lipide-bevattende droge ogen producten te vergelijken voor hun effect op HCEC metabolische activiteit met en zonder uitdroging. De ingrediënten in de geteste droge ogen worden beschreven in De Tabel van Materialen. De ingrediënten in oplossing #1 zijn carboxymethylcellulosenatrium (0,5%), glycerine (1%) en polysorbaat 80 (0,5%), in oplossing #2 het lichte minerale olie zijn (1,0%) en minerale olie (4,5%), en in oplossing #3 is het lipide minerale olie en propyleenglycol het demulcente. Deze lipiden zijn de formuleringscomponenten die naar verwachting bescherming van de HCEC tegen uitdroging zullen bieden.

Protocol

1. Menselijke hoornvliesepitheelcelcultuur Kweek vereeuwigde HCEC19 in met collageen bedekte 75 cm2 kolven met 20 ml Dulbecco’s gemodificeerde Eagle medium/nutriëntenmengsel F-12 (DMEM/F12) met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine bij 37 °C met 5% CO2.OPMERKING: Schudden is niet vereist. Verander de media om de 2−3 dagen. 2. Voorbereiding van cellen voor testen Nadat de cellen bijna samenvloeien verwijder kweekmedia. Voeg 4−6 ml celdisassociatieoplossing toe aan elke kolf van 75 cm2. Incubeer de cellen bij 37 °C totdat de cellen losraken (ongeveer 20−30 min), en controleer regelmatig onder de microscoop. Voeg 2−6 ml DMEM/F12 met 10% FBS toe aan elke kolf van 75 cm2. Breng de inhoud van de kolf over in een centrifugebuis van 50 ml. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten op 450−500 x g. Pipet uit de supernatant en resuspend de cellen in voorverwarmde media. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Bereken het volume van de media die in totaal 1 x 105 cellen bevatten. Voeg 1 x 105 cellen toe aan elke put van een 48 well collageen-1 gecoate kweekplaat. Voeg voldoende media toe aan de put zodat het uiteindelijke volume van de media in de put 0,5 ml cultuur DMEM/ F12 met 10% FBS is.OPMERKING: Een kunstmatige traanformulering kan cytotoxiciteit veroorzaken die kan worden gemeten door een afname van de metabolische activiteit van HCEC. De consistentie van de gegevens is afhankelijk van het toevoegen van hetzelfde aantal HCEC aan elke put bij het zaaien. De cultuurconcentratie die wordt aanbevolen voor 48 putplaten is 1 x 105. Omdat zoogdiercellen zich na resuspending in de centrifugebuis kunnen nestelen, wordt aanbevolen om de cellen regelmatig te resuspenden door te roeren terwijl de platen met cellen worden gezaaid, zodat de celsuspensie de HCEC gelijk verdeeld heeft. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur. 3. Geen uitdrogingsprotocol Controleprocedure Verwijder na de incubatie van 24 uur de kweekmedia van de plaat. Onmiddellijk behandelen met 150 μL van een testformulering en mediacontroleoplossing. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 30 min. Verwijder de testoplossingen uit de cellen. Voeg 0,5 ml 10% metabolische kleurstofoplossing toe om te testen op metabole activiteit. Incubeer de cellen nog eens 4 uur bij 37 °C en 5% CO2. Verwijder na de incubatieperiode van 4 uur 100 μL metabolische kleurstofoplossing uit elke put en plaats elke 100 μL in een put van een plaat van 96 put. Meet de fluorescentie van elke put met behulp van een fluorescerende plaatlezer(Tabel van materialen). Stel de excitatiegolflengte in op 540 nm en de emissiegolflengte op 590 nm. Geen uitdrogingsprotocol (herstelprocedure) Herhaal stap 3.1.1−3.1.4. Voeg 0,5 ml DMEM/F12-media toe aan elke put. Incubeer één reeks culturen gedurende 18 uur bij 37 °C en 5% CO2. Verwijder de media en voeg 0,5 ml 10% metabolische kleurstofoplossing toe. Herhaal stap 3.1.6 en 3.1.7. 4. Uitdrogingsprotocol Controleprocedure Verwijder na de incubatie van 24 uur (stap 2.8) de kweekmedia van de plaat. Onmiddellijk behandelen met 150 μL van een testformulering en mediacontroleoplossing. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 30 min. Verwijder de testoplossingen uit de cellen. Plaats de cellen gedurende 5 minuten in een 37 °C- en 45%-rv-kamer om de cellen uit te latendrogen. Voeg 0,5 ml 10% metabolische kleurstofoplossing toe om de metabolische activiteit te testen. Incubeer de cellen nog eens 4 uur bij 37 °C en 5% CO2. Verwijder na de incubatieperiode van 4 uur 100 μL metabolische kleurstofoplossing uit elke put en plaats elke 100 μL in een put van een plaat van 96 put. Meet de fluorescentie van elke put met behulp van een fluorescerende plaatlezer. Stel de excitatiegolflengte in op 540 nm en de emissiegolflengte op 590 nm. Terugvorderingsprocedure Herhaal stap 4.1.1-4.1.5. Voeg 0,5 ml DMEM/F12-media toe aan elke put. Incubeer één reeks culturen gedurende 18 uur bij 37 °C en 5% CO2. Verwijder de media en voeg 0,5 ml 10% metabolische kleurstofoplossing toe. Herhaal stap 4.1.7 en 4.1.8. 5. Gegevensanalyse Bereken de gemiddelde fluorescentie van de mediabesturing. Bereken het percentage levensvatbaarheid van het monster met behulp van de volgende formule:Procentuele levensvatbaarheid van het monster = fluorescentie van het testmonster/mediacontrole fluorescentie x 100OPMERKING: Het mediacontrolegemiddelde is 100% levensvatbaar. De metabolische kleurstof op zichzelf heeft een kleine hoeveelheid fluorescentie geassocieerd met het. De fluorescentie van het metabolische kleurstofreagens kan van de fluorescentie van het controle- en testmonster worden afgetrokken voordat de levensvatbaarheid van de testmonsters voor de mediacontrole wordt berekend. Voer een normaliteitstest en een test uit op gelijke afwijkingen op de controle- en testmonsters. Als de normaliteitstest slaagt en de afwijkingen gelijk zijn, voer dan een eenrichtings-ANOVA uit. Om significante verschillen tussen specifieke groepen te identificeren, voert u een paarsgewijze vergelijkingen uit na de hoc-test (d.w.z. de meervoudige vergelijkingstests van Tukey of Dunnett). Als de normaliteitstest slaagt en de afwijkingen verschillen, voer dan de ANOVA van de Welch uit. Om significante verschillen tussen specifieke groepen te identificeren, voert u een paarsgewijze vergelijkingen uit na de hoctest (d.w.z. dunnett’s of Games-Howell meerdere vergelijkingstests). Als de normaliteitstest mislukt, gebruik dan een niet-parametrische test (d.w.z. Kruskal-Wallis-test). Om significante verschillen tussen specifieke groepen te identificeren, voert u een paarsgewijze vergelijkingen uit na de hoctest (d.w.z. de test van Dunn).

Representative Results

De resultaten van een studie waarin drie droge ogenformuleringen werden vergeleken , zijn weergegeven in figuur 1. Uit deze figuur blijkt dat er verschillen zijn in het effect van de drie producten, oplossing #1, oplossing #2 en oplossing #3 (Tabel van materialen) op de levensvatbaarheid van HCEC. Oplossing #1 en oplossing #2 een significant effect gehad op de metabolische activiteit van HCEC vóór uitdroging. Dit betekent dat er formuleringscomponenten in deze producten zijn die de metabolische activiteit van de HCEC kunnen verstoren. De extra daling van de cel metabolische activiteit die optrad na 18 uur herstel van cellen blootgesteld aan oplossing #1 toont aan dat HCEC aanvankelijk gewond raakte en na 18 uur het letsel niet werd hersteld. Ter vergelijking, oplossing #3 slechts een mild effect had op de metabolische activiteit van de HCEC. Figuur 2 toont het effect van deze lipide-bevattende droge ogen formuleringen op celbescherming. Met een metabolische activiteit van bijna 0% HCEC bij het herstelinterval van 18 uur beschermden oplossings- #1 en oplossing #2 cellen niet tegen uitdrogingsstress. Oplossing #3 bood echter enige bescherming tegen uitdrogingsstress. Figuur 1: Effect van droge ogen lipide verbeterde producten op de levensvatbaarheid van de cel. Relatieve levensvatbaarheid gemeten door HCEC metabole activiteit na behandeling met lipide-bevattende droge ogen producten. * = statistische significantie (p < 0,05) ten opzichte van oplossing #3, Δ = statistische significantie (p < 0,05) ten opzichte van de mediacontrole voor de juiste herstelperiode. De hoogte van de balk vertegenwoordigt de gemiddelde waarde en de foutbalken zijn de SD. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 2: Effect van droge ogen lipide verbeterde producten op uitdroging bescherming. Effect van lipide-bevattende droge ogen formuleringen op celbescherming. Oplossing #1 en oplossing #2 de cellen niet beschermd tegen uitdrogingsstress en ze herstelden niet van uitdrogingseffecten in de loop van de tijd. Oplossings- #3 daarentegen enige bescherming bood tegen uitdrogingsstress. * = p < 0,05 ten opzichte van oplossing #3, en Δ = p < 0,05 ten opzichte van onbehandelde (controle)media gedurende de juiste hersteltijd. De hoogte van de balk vertegenwoordigt de gemiddelde waarde en de foutbalken zijn de SD. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Dit protocol is ontworpen om de beschermende effecten van kunstmatige scheuroplossingen tegen celuitdroging te bepalen. In eerste instantie worden de cellen blootgesteld aan de droge oogdruppels om de cellen te coaten. Vervolgens worden de cellen gedroogd en wordt de metabolische activiteit gecontroleerd om te beoordelen of de formuleringen de schadelijke effecten van uitdrogingsstress kunnen verminderen. Deze stappen zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van de algehele impact die de droge ogen formuleringen kunnen hebben op de algehele levensvatbaarheid van cornea epitheelcellen.

Nadat de meeste droge oogformuleringen uit de kweekputten zijn verwijderd, zal de chemie van de resterende moleculen die in contact komen met de cellen van invloed zijn op de uitdroging van cellen. Sommige producten bevatten micro-emulsies van oliën die celverdamping minimaliseren20. Een studie die de wrijvingsanalyse na het spoelen evalueerde, toonde aan dat de wrijvingsarme samenstellingen voor sommige droge ogen werden aangehouden, wat een indicator kan zijn voor de verbeterde verblijftijd van de droge-ogenformuleringen21. Een van de beperkingen van deze test is dat hoewel uitdrogingsbescherming kan worden geëvalueerd in vergelijking met andere oogdruppelformuleringen, de duur van deze bescherming niet kan worden bepaald vanwege de korte droogtijd die wordt beoordeeld. Langere droogtijden in deze in vitro test kunnen het gebruik van meerlaagse culturen vereisen die over het algemeen meer vochtgehalte hebben dan een celmonolaag.

De specifieke incubatietijden voor de formuleringen op de cellen en de duur van de droogtijd moeten mogelijk worden aangepast als de temperatuur- en vochtigheidswaarden worden gewijzigd. Het selecteren van een temperatuur, RV en luchtstroom voor het simuleren van omgevingsstressomstandigheden die kunnen bijdragen aan droge ogen kan moeilijk zijn, omdat de seizoensgebonden en lokale omgevingsomstandigheden vrij variabel zijn21. Moderne omgevingskamers voor menselijke studies kunnen de temperatuur variëren tussen 5 °C en 35 °C, en RV tussen 5% en 95%22. Met behulp van een evaporimeter en een goed gemonteerde bril werd vastgesteld dat bij RH van 40−45% de verdampingssnelheid uit het hoornvlies 0,037 μL/cm2/min was en bij RV van 20−25% de verdampingssnelheid 0,065 μL/cm2/min23. Als het in vitro model kijkt naar het beschermende effect van formuleringen onder extreem lage RH-omstandigheden zoals in vliegtuigen15,woestijnen of droge binnenomgevingen16,moeten de incubatietijden mogelijk worden verkort om de verbeterde verdampingssnelheden van de cellen op te vangen. In de menselijke traanvloeistof zijn een verscheidenheid aan lipiden afkomstig van meibomian en andere klieren aanwezig die de tranen beschermen tegen verdamping. Deze lipiden hebben verschillende smeltpunten24. Temperatuurveranderingen kunnen van invloed zijn op de vloeibaarheid van de traanvloeistof, zodat tests bij omgevingstemperatuur aanzienlijk andere verdampingssnelheden kunnen hebben dan tests bij 37 °C. Aangezien het gemiddelde oculaire oppervlaktetemperatuurbereik van 32,9 tot 36 °C25ligt, wordt het aanbevolen om de test in de buurt van dit temperatuurbereik uit te voeren.

Naast de metabolische kleurstof (alamarBlue) die in dit protocol wordt gebruikt, zijn er andere chemische reagentia die kunnen worden gebruikt om de effecten van productformuleringen op de metabolische activiteit van cellen te beoordelen. De tetrazoliumzouten (MTT, XTT, MTS, WST) zijn alternatieve chemicaliën die kunnen worden gebruikt. Het verschil in de tetrazoliumzouten is dat MTT een positief geladen molecuul is, zodat het het cytoplasma van levende cellen kan binnendringen26. MTT wordt onoplosbaar na de verlaging ervan met NAD(P)H27. Het moet oplosbaar zijn voordat de leesabsorpiteit op een plaatlezer wordt opgeschreven. De andere tetrazoliumzouten zijn negatief geladen28. Ze moeten worden verminderd door secundaire moleculen buiten de levende cel omdat ze de cel niet kunnen binnendringen en rechtstreeks kunnen interageren met intracellulaire moleculen29. Voor de XTT-, MTS- en WST-1-test kan de toevoeging van een elektronenkoppelingsmiddel 1-methoxy fenazinemethosulfaat (PMS) de prestaties van de assaysverbeteren 30. In tegenstelling tot de metabolische assays die tetrazoliumzouten gebruiken, heeft alamarBlue geen extra oplosbaarheids- of elektronenkoppelingsmiddelen nodig. Ook, in tegenstelling tot XTT, MTS of WST-1, alamarBlue dringt celmembranen en kan direct worden verminderd door cellulaire enzymen27,29. Directe vergelijking van alamarBlue met tetrazoliumzouten heeft aangetoond dat alamarBlue gevoeliger is voor het evalueren van de metabolische activiteit van verschillende cellijnen, waaronder HCEC3,27,31,32.

Andere biochemische eindpunten kunnen ook worden overwogen voor het evalueren van de bescherming van menselijke hoornvliesepitheelcellen door uitdroging. Fluorescerende kleurstoffen kunnen worden gebruikt om de permeabiliteit van het celmembraan en de celesteraseactiviteit te detecteren1. Ook kan apoptose worden gedetecteerd door kleuring voor apoptotische markers op het celoppervlak of door te meten op caspase-activiteit1,33. Andere assays hebben de effecten van oogheelkundige producten op HCEC-nauwe verbindingen bepaald34. Deze tests kunnen worden opgenomen in toekomstige beoordelingen met behulp van de uitdrogingsprocedures die in dit artikel worden beschreven.

Er zijn veel oorzaken van droge ogen. Droge ogen kunnen worden veroorzaakt door verminderde afscheiding van tranen, verhoogde ontsteking van het oculaire oppervlak of verhoogde uitdroging aan het oculaire oppervlak. Voor de personen die verdamping droge ogen gebruik van een droge oogdruppel die voorkomt dat hun cellen drogen tijdens uitdroging voorwaarden kunnen verlichten de symptomen van droge ogen. Een van de problemen in sommige droge ogen formuleringen is de aanwezigheid van conserveermiddelen die het oculaire oppervlak kunnen beschadigen. Het verwonden van cellen is niet nuttig voor droge ogenpatiënten, omdat het ervoor kan zorgen dat meer cellen afsterven omdat gewonde cellen vatbaarder zijn voor uitdrogingsstress35.

Een recent overzichtsartikel van Garrigue et al.36 geeft een beoordeling van de huidige kennis over hoe producten op basis van lipiden werken om verdamping van droge ogen te verlichten. Het toevoegen van lipiden aan lipidentekorttranen kan verdamping voorkomen, waardoor de cellen worden beschermd tegen uitdroging. Bovendien zijn bevochtigingsmiddelen moleculen die water aantrekken en vasthouden aan het oculaire oppervlak37. Zowel glycerine in oplossing #1 als propyleenglycol in oplossing #3 zijn bevochtigingsmiddelen. Solution #3 vertoonden een groter beschermend effect van de HCEC dat mogelijk te wijten was aan de lipide- en bevochtigingseigenschappen van de formuleringsingrediënten.

Dit protocol is ontworpen om de metabolische activiteit van HCEC te evalueren na blootstelling aan de droge ogen formuleringen en aan uitdrogingsstress. Door gebruik te maken van de methoden die in dit artikel worden beschreven, kunnen nieuwe niet-irriterende en beschermende oogdruppels worden ontwikkeld voor mensen die last hebben van verdampingsdroog oog.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs danken Alcon voor het verlenen van financiële steun voor deze studies.

Materials

75 cm2 Vented Flask Corning 354485 This is the BioCoat brand collagen coated
96 well plate costar 3370
alamarBlue Fisher Scientific dal 1025
Corning 48 Well plates Corning 354505 This is the BioCoat brand collagen coated
Cytation 5 BioTek CYT5MPV Can read fluorescence from 280 – 700 nm (for assay 540/590)
DMEM/F12 with L-glutamine and 15 mM HEPES Gibco 11039-021 There is No Phenol Red in this media
Fetal Bovine Serum Hycone SH30396.03
Human Corneal Epithelial Cells University of Ottawa N/A SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169–72.
Humidity/Temperature Chamber Associated Environmental Systems LH-1.5 Economy Line Humidity Chamber
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 100X concentration so add 1ml to each 99ml of media
Refresh Optive Advanced (solution #1) Allergan, Inc Carboxymethylcellulose Sodium (0.5%),Glycerin (1%),polysorbate 80 (0.5%),-Lubricants- Inactive ingredients-boric acid; carbomer copolymer type A; castor oil; erythritol; levocarnitine; purified water; Purite (stablized oxychloro complex)and may contain sodium hydroxide to adjust pH.
Soothe XP (solution #2) Bausch & Lomb Light mineral oil (1.0%), Mineral Oil (4.5%)-emolients-Inactive ingredients-boric acid, edetate disodium, octoxynol-40, polyquaternium-1 (preservative), polysorbate 80, purified water, sodium borate decahydrate. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide (to adjust pH).
Systane Complete (solution #3) Alcon Inc. Propylene Glycol 0.6% Lubricant Inactive ingredients- boric acid, dimyristoyl phosphatidylglycerol, edatate disodium, hydroxypropyl guar, mineral oil, polyoxl 40 stearate, POLYQUAD® (polyquaternium-1) 0.001% preservative, sorbitan tristearate, sorbitol and purified water. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide to adjust pH.
TrypLE Express (cell disassociation solution) Fisher Scientific 12605036
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
  2. Maurer, J. K., et al. Quantitative measurement of acute corneal injury in rabbits with surfactants of different type and irritancy. Toxicology and Applied Pharmacology. 158 (1), 61-70 (1999).
  3. Xu, M. L., McCanna, D. J., Sivak, J. G. Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).
  4. Slaughter, M. R., Bugelski, P. J., O’Brien, P. J. Evaluation of alamar blue reduction for the in vitro assay of hepatocyte toxicity. Toxicology in Vitro. 13 (4-5), 567-569 (1999).
  5. Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
  6. Paulsen, K., Maile, S., Giebel, J., Tost, F. Lubricating agents differ in their protection of cultured human epithelial cells against desiccation. Medical Science Monitor. 14 (6), 12-16 (2008).
  7. Tost, F., Keiss, R., Grossjohann, R., Jurgens, C., Giebel, J. Effect of different artificial tears against desiccation in cultured human epithelial cells. Medical Science Monitor. 18 (5), 188-192 (2012).
  8. Ubels, J. L., et al. Pre-clinical investigation of the efficacy of an artificial tear solution containing hydroxypropyl-guar as a gelling agent. Current Eye Research. 28 (6), 437-444 (2004).
  9. Hovakimyan, M., et al. Evaluation of protective effects of trehalose on desiccation of epithelial cells in three dimensional reconstructed human corneal epithelium. Current Eye Research. 37 (11), 982-989 (2012).
  10. Zheng, X., Goto, T., Shiraishi, A., Ohashi, Y. In vitro efficacy of ocular surface lubricants against dehydration. Cornea. 32 (9), 1260-1264 (2013).
  11. Matsuo, T. Trehalose protects corneal epithelial cells from death by drying. British Journal of Ophthalmology. 85 (5), 610-612 (2001).
  12. Zheng, Q., et al. Reactive oxygen species activated NLRP3 inflammasomes initiate inflammation in hyperosmolarity stressed human corneal epithelial cells and environment-induced dry eye patients. Experimental Eye Research. 134, 133-140 (2015).
  13. Hua, X., et al. Protective Effects of L-Carnitine Against Oxidative Injury by Hyperosmolarity in Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5503-5511 (2015).
  14. Schulze, U., et al. Trefoil factor family peptide 3 (TFF3) is upregulated under experimental conditions similar to dry eye disease and supports corneal wound healing effects in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 3037-3042 (2014).
  15. Giaconia, C., Orioli, A., Di Gangi, A. Air quality and relative humidity in commercial aircrafts: An experimental investigation on short-haul domestic flights. Building and Environment. 67, 69-81 (2013).
  16. van Setten, G., Labetoulle, M., Baudouin, C., Rolando, M. Evidence of seasonality and effects of psychrometry in dry eye disease. Acta Ophthalmologica. 94 (5), 499-506 (2016).
  17. Valtink, M., Donath, P., Engelmann, K., Knels, L. Effect of different culture media and deswelling agents on survival of human corneal endothelial and epithelial cells in vitro. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (2), 285-295 (2016).
  18. Zachari, M. A., et al. Evaluation of the Alamarblue Assay for Adherent Cell Irradiation Experiments. Dose-Response. 12 (2), 246-258 (2014).
  19. Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
  20. Benelli, U. Systane lubricant eye drops in the management of ocular dryness. Clinical Ophthalmology. 5, 783-790 (2011).
  21. Davis, R. E., McGregor, G. R., Enfield, K. B. Humidity: A review and primer on atmospheric moisture and human health. Environmental Research. 144 (Pt A), 106-116 (2016).
  22. Calonge, M., et al. Controlled Adverse Environment Chambers in Dry Eye Research. Current Eye Research. 43 (4), 445-450 (2018).
  23. McCulley, J. P., Uchiyama, E., Aronowicz, J. D., Butovich, I. A. Impact of evaporation on aqueous tear loss. Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 121-128 (2006).
  24. Bron, A. J., Tiffany, J. M., Gouveia, S. M., Yokoi, N., Voon, L. W. Functional aspects of the tear film lipid layer. Experimental Eye Research. 78 (3), 347-360 (2004).
  25. Purslow, C., Wolffsohn, J. S. Ocular surface temperature: a review. Eye & Contact Lens. 31 (3), 117-123 (2005).
  26. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
  27. Stockert, J. C., Horobin, R. W., Colombo, L. L., Blazquez-Castro, A. Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives. Acta Histochemica. 120 (3), 159-167 (2018).
  28. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  29. Rampersad, S. N. Multiple Applications of Alamar Blue as an Indicator of Metabolic Function and Cellular Health in Cell Viability Bioassays. Sensors. 12 (9), 12347-12360 (2012).
  30. Li, J., Zhang, D. L., Ward, K. M., Prendergast, G. C., Ayene, I. S. Hydroxyethyl disulfide as an efficient metabolic assay for cell viability in vitro. Toxicology in Vitro. 26 (4), 603-612 (2012).
  31. Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells. Cytotechnology. 68 (4), 1489-1498 (2016).
  32. Uzunoglu, S., et al. Comparison of XTT and Alamar blue assays in the assessment of the viability of various human cancer cell lines by AT-101 (-/- gossypol). Toxicology Mechanisms and Methods. 20 (8), 482-486 (2010).
  33. McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), a026716 (2015).
  34. McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
  35. Puhlev, I., Guo, N., Brown, D. R., Levine, F. Desiccation tolerance in human cells. Cryobiology. 42 (3), 207-217 (2001).
  36. Garrigue, J. S., Amrane, M., Faure, M. O., Holopainen, J. M., Tong, L. Relevance of Lipid-Based Products in the Management of Dry Eye Disease. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 33 (9), 647-661 (2017).
  37. Lievens, C., et al. Evaluation of an enhanced viscosity artificial tear for moderate to severe dry eye disease: A multicenter, double-masked, randomized 30-day study. Contact Lens & Anterior Eye. 42 (4), 443-449 (2019).

Tags

Corneal Epithelial CellsDesiccationArtificial Tear FormulationsMetabolic ActivityCell CultureCell Viability AssayFluorescence Measurement

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Rangarajan, R., Ketelson, H. A., Do, R., McCanna, D. J., Suko, A., Enstone, D., Subbaraman, L. N., Dantam, J., Jones, L. W. Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation. J. Vis. Exp. (159), e60812, doi:10.3791/60812 (2020).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image