JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Médecine

Влияние искусственных слезных формулировок на метаболическую активность эпителиальных клеток роговицы человека после воздействия высыхания

Published: May 02, 2020
doi:
10.3791/60812
, , , , , , , ,
1Alcon Vision, LLC, 2Centre for Ocular Research and Education (CORE), School of Optometry & Vision Science,University of Waterloo

Summary

Цель этого протокола заключается в оценке, если различные искусственные слезы формулировки могут защитить человека роговицы эпителиальных клеток от высыхания с помощью модели in vitro. После воздействия искусственных слезных составов и высыхания эпителиальные клетки роговицы человека оцениваются на метаболическую активность.

Abstract

Искусственные липидосодержащие слезоточивые составы разрабатываются для уменьшения испарения слез путем восстановления недостаточного слезного липидного слоя. Искусственные слезоточивые составы, предотвращая высыхание клеток, приведут к защите глазной поверхности и поддержанию метаболической активности клеток. Во время обезвоживания клетки проходят процесс потери метаболической активности и последующей гибели клеток. В этой работе описывается метод оценки эффективности искусственных слезных составов. Метаболический краситель (т.е. alamarBlue) меняется от низкофлуоресцентной молекулы ресазурина к флуоресцентной молекуле ресоруфина в жизнеспособных клетках. Биологическая производительность искусственной слезоточивой формулировки измеряется как способность формулы (а) поддерживать жизнеспособность клеток и b) обеспечивать защиту клеток от высыхания. Средства роста и солевой раствор используются в качестве элементов управления для тестов жизнеспособности/высыхания клеток. Клетки инкубируется с тестовыми растворами в течение 30 мин, а затем высасывной в течение 0 или 5 мин при 37 градусов по Цельсию и 45% относительной влажности. Затем определяется метаболическая активность клеток после первоначального воздействия и после высыхания клеток. Результаты показывают сравнительное влияние формулировок глазных капель на метаболическую активность клеток и защиту от высыхания. Этот метод может быть использован для проверки сухих глаз формулировки, которые предназначены для лечения людей с испарительным сухим глазом.

Introduction

Для поддержания стабильности, рН, осмоляности и эффективности необходимо много различных ингредиентов в многодозных офтальмологических растворах. Тем не менее, некоторые химические вещества, такие как консерванты или сурфактанты в глазных растворах может привести к повреждениюэпителия роговицы 1,2. Тесты жизнеспособности клеток с использованием эпителиальных клеток роговицы человека (HCEC) могут быть выполнены для оценки потенциального ущерба, причиненного этими различными ингредиентами в офтальмологических составах. Один из анализов in vitro, что особенно полезно для оценки повреждения клеток является alamarBlue анализ3. В этом анализе метаболический краситель (т.е. alamarBlue) содержит резазурин, который функционирует как индикатор жизнеспособности клеток. Во время клеточного дыхания, резазурин сводится к resorufin путем принятия электронов4. Сокращение ресоруфина вызывает изменение от нефлуоресцентной молекулы к флуоресцентной молекуле, которая может быть обнаружена с помощью спектрофторометра5.

Это исследование использует два различных лечения эпителиальных клеток роговицы, чтобы определить, как сухие продукты глаз может выполнять в пробирке модели. В первой оценке, клетки обрабатываются этими продуктами в течение 30 мин. После лечения клетки оцениваются на метаболическую активность сразу после контакта с продуктами сухого глаза и после интервала времени восстановления. Эта оценка определяет влияние этих продуктов на клетки до высыхания в камере влажности. Раствор консервантов, сурфактантов или буферов в этих решениях может иметь некоторые цитотоксические эффекты на клетки, которые могут быть обнаружены с помощью метаболического красителя.

Вторая оценка определяет метаболическую активность клеток после воздействия сухих продуктов глаз и высыхания. В этой оценке, если лечение продукта обеспечивает защиту клеток от повреждения от высыхания, метаболическая активность клеток будет поддерживаться. Защита клеток от вредного воздействия высыхания может произойти, если сухой глаз продукт может покрыть клетки с липидами или продукт может поглощать жидкость из окружения добавления влаги в клетки.

Этот протокол предназначен для имитации тяжелых условий экологической нагрузки на клетки. Другие исследования использовали различные модели для создания этого внешнего стресса. Некоторые исследования высушили клетки в ламинарныхкапюшонах потока 6,7,8, в то время как другие использовали комнатную температуру и различные относительные значения влажности (RH)9,10,11. Метод моделирования сухих глазных условий заключается в увеличении осмолярности инкубационныйраствор 12,13. Другой метод in vitro для имитации неблагоприятных условий окружающей среды заключается в том, чтобы добавить цитокины в клеточные средства массовой информации для имитации слезоточивой жидкости пациентовсухого глаза 14. Хотя эти тесты являются интересными моделями, которые могут оценить, как химические вещества уменьшить осмотический стресс или стимулировать иммунную систему, эти модели непосредственно не показывают, как химические формулировки могут защитить клетки от высыхания стресса.

Модель высыхания использует температурную/влаговую камеру 37 градусов по Цельсию и 45% RH. Он имитирует условия окружающей среды, которые могут вызвать испарение с глазной поверхности. Моделирование других экстремальных экологических условий, таких как низкая влажность в салонахсамолетов 15 или в помещении в зимниемесяцы 16 также может быть выполнено с помощью этого метода.

Моделирование клеточной культуры используется для имитации влияния высыхания нагрузки на роговицу человека. Для того, чтобы обнаружить клеточный стресс, тестирование жизнеспособности клеток проводится для определения воздействия на здоровье клеток. Несколько различных физиологических тестов могут быть выполнены на клетках, чтобы определить, если ониподчеркнули 17. Анализ, выполненный в этой процедуре тестирования использует коммерчески доступный метаболическийкраситель (Таблица материалов). Он имеет преимущество над многими другими тестами стресса клеток в том, что он не токсичен, растворим в средствах роста и может оценить клетки без фиксацииклеток 18. В этой процедуре клетки проверяются на метаболическую активность сразу после каждого лечения и второй набор клеток помещаются обратно в средства роста и оцениваются после 18 ч восстановления. Причина для тестирования сразу же, а затем после периода восстановления заключается в выявлении повреждения клеток, что вызывает немедленное воздействие на метаболическую активность и повреждение клеток, что вызывает задержки эффектов. Кроме того, он дает возможность оценить влияние этих формулировок на краткосрочный и долгосрочный ущерб и способность формулировок восстановить/не оправиться от первоначального оскорбления.

Это исследование используется для сравнения различных липидосодержащих сухих глаз продуктов для их влияния на метаболическую активность HCEC с и без высыхания. Ингредиенты в проверенных продуктах сухого глаза описаны в таблице материалов. Ингредиентами в растворе #1 являются карбоксиметилцеллюлоза натрия (0,5%), глицерин (1%) и полисорбат 80 (0,5%), в растворе #2 это легкое минеральное масло (1,0%) и минеральное масло (4,5%), а в #3 липид является минеральным маслом, а пропиленгликоль – демульсентным. Эти липиды являются составными компонентами, которые, как ожидается, обеспечат защиту HCEC от высыхания.

Protocol

1. Культура эпителиальных клеток роговицы человека Выращиваем увековеченный HCEC19 в коллагеновых 75см 2 колбы с 20 мл модифицированной иглы Dulbecco среднего / питательной смеси F-12 (DMEM/F12), содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина при 37 С с 5% CO2.ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхивание не требуется. Меняются средства массовой информации каждые 2–3 дня. 2. Подготовка клеток к тестированию После того, как клетки почти стекут удалить культуру средств массовой информации. Добавьте 4-6 мл раствора отмежевания клеток к каждой колбе75 см 2. Инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию, пока клетки не отсоединится (примерно 20-30 мин), периодически проверяя под микроскопом. Добавьте 2–6 мл DMEM/F12, содержащий 10% FBS, к каждой колбе 75см 2. Перенесите содержимое колбы в центрифугу 50 мл. Центрифуга клетки на 450-500 х г в течение 5 мин. Пипетка из супернатантов и повторного перерасхода клеток в предварительно разогретых средств массовой информации. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Рассчитайте объем мультимедиа, содержащий в общей сложности 1 x 105 ячеек. Добавьте 1 x 105 клеток к каждому хорошо 48 хорошо коллагена-1 покрытием пластины культуры. Добавьте достаточное количество средств массовой информации к хорошо, так что окончательный объем средств массовой информации в колодец составляет 0,5 мл культуры DMEM/F12 с 10% FBS.ПРИМЕЧАНИЕ: Искусственная слезоточивая формула может вызвать цитотоксию, которая может быть измерена снижением метаболической активности HCEC. Согласованность данных зависит от добавления одинакового количества HCEC к каждому хорошо при посевной. Концентрация культуры, которая рекомендуется для 48 пластин хорошо 1 х 105. Поскольку клетки млекопитающих могут осесть в центрифуге трубки после повторного перерасхода, рекомендуется повторно использовать клетки путем возбуждения часто при посеве пластин с клетками, так что подвеска клетки имеет HCEC равномерно распределены. Инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 для 24 ч. 3. Нет протокола высыхания Процедура контроля После инкубации 24 ч снимите культурные медиа с пластины. Немедленно обработать 150 МЛ тестовой формулировки и решения для управления мультимедиа. Инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 в течение 30 мин. Удалите тестовые растворы из ячеек. Добавьте 0,5 мл 10% раствора метаболического красителя для проверки на метаболическую активность. Инкубировать клетки еще на 4 ч при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2. После инкубации 4 ч, удалить 100 йл раствора метаболического красителя из каждой хорошо и поместить каждые 100 йл в колодец 96 хорошо пластины. Измерьте флуоресценцию каждой хорошо с помощью флуоресцентного считывателяпластин (Таблица материалов). Установите длину волны возбуждения на уровне 540 нм и длину волны выброса на уровне 590 нм. Нет протокола высыхания (процедура восстановления) Повторите шаги 3.1.1-3.1.4. Добавьте 0,5 мл средств массовой информации DMEM/F12 к каждой из них. Инкубировать один набор культур для 18 ч при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2. Удалите средства массовой информации и добавьте 0,5 мл 10% раствора метаболического красителя. Повторите шаги 3.1.6 и 3.1.7. 4. Протокол высыхания Процедура контроля После инкубации 24 ч (шаг 2.8), удалите культурные средства массовой информации из пластины. Немедленно обработать 150 МЛ тестовой формулировки и решения для управления мультимедиа. Инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 в течение 30 мин. Удалите тестовые растворы из ячеек. Поместите клетки в 37 градусов по Цельсию и 45% RH камеры в течение 5 минут, чтобы высвясить клетки. Добавьте 0,5 мл 10% раствора метаболического красителя для проверки метаболической активности. Инкубировать клетки еще на 4 ч при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2. После инкубации 4 ч, удалить 100 йл раствора метаболического красителя из каждой хорошо и поместить каждые 100 йл в колодец 96 хорошо пластины. Измерьте флуоресценцию каждой хорошо с помощью флуоресцентного считывателя пластин. Установите длину волны возбуждения на уровне 540 нм и длину волны выброса на уровне 590 нм. Процедура восстановления Повторите шаги 4.1.1-4.1.5. Добавьте 0,5 мл средств массовой информации DMEM/F12 к каждой из них. Инкубировать один набор культур для 18 ч при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2. Удалите средства массовой информации и добавьте 0,5 мл 10% раствора метаболического красителя. Повторите шаги 4.1.7 и 4.1.8. 5. Анализ данных Рассчитайте среднюю флуоресценцию управления мультимедиа. Рассчитайте процентную жизнеспособность образца по формуле:Процентная жизнеспособность образца – тест образца флуоресценции/медиа-контроля флуоресценции x 100ПРИМЕЧАНИЕ: Средний показатель контроля мультимедиа составляет 100% жизнеспособность. Метаболический краситель сам по себе имеет небольшое количество флуоресценции, связанные с ним. Флуоресценция реагента метаболического красителя может быть вычтена из контрольного и тестового образца флуоресценции до расчета % жизнеспособности тестовых образцов для контроля мультимедиа. Выполните тест на нормальность и тест на равные отклонения в образцах управления и тестирования. Если тест на нормальность проходит и отклонения равны, то выполните одноуговую ANOVA. Для выявления существенных различий между конкретными группами выполните парные сравнения после специального теста (т.е. несколько тестов сравнения Tukey или Dunnett). Если тест на нормальность проходит и отклонения различны, то выполните ANOVA Уэлча. Для выявления существенных различий между конкретными группами выполните парные сравнения после специального теста (т.е. тесты Даннетта или Games-Howell с несколькими сравнениями). Если тест на нормальность не выполняется, используйте непараметрический тест (т.е. тест Крускаль-Валлиса). Для выявления существенных различий между конкретными группами выполните парные сравнения после специального теста (т.е. теста Данна).

Representative Results

Результаты исследования, сравнивая три сухих глаз формулировки показаны на рисунке 1. Эта цифра показывает, что существуют различия в том, как три продукта, #1, #2 и решение #3(Таблица материалов)имеют на жизнеспособность HCEC. Решение #1 и раствор #2 значительное влияние на метаболическую активность ГХЭК до высыхания. Это означает, что в этих продуктах есть компоненты рецептуры, которые могут нарушить метаболическую активность HCEC. Дополнительное снижение клеточной метаболической активности, которое произошло после 18 ч восстановления клеток, подвергшихся воздействию раствора #1 показывает, что HCEC были ранены первоначально и после 18 ч травма не была восстановлена. Для сравнения, #3, которое лишь мягко влияет на метаболическую активность ВГЭК. Рисунок 2 показывает влияние этих липидсодержащих сухих глаз формулировки на защиту клеток. При почти 0% метаболической активности HCEC с интервалом восстановления 18 ч, #1 и раствор #2 не защищают клетки от высыхания стресса. Решение #3, однако, предложил некоторую защиту от высыхания стресса. Рисунок 1: Влияние сухого липида глаза расширенные продукты на жизнеспособность клеток. Относительная жизнеспособность измеряется метаболической активностью HCEC после лечения липидосодержащих продуктов сухого глаза. Статистическая значимость (p < 0.05) по отношению к решению #3, й статистическая значимость (p < 0.05) по отношению к контролю средств массовой информации за соответствующий период восстановления. Высота бара представляет среднее значение, а бары ошибок являются SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Влияние сухого липида глаза расширенные продукты на защиту от высыхания. Влияние липидосодержащих сухих глазных составов на защиту клеток. Раствор #1 раствор и #2 не защищал клетки от высыхания стресса, и они не оправились от последствий высыхания с течением времени. В отличие от этого, #3 предлагает некоторую защиту от высыхания стресса. p-< 0,05 по отношению к #3, и p < 0,05 по отношению к необработанным (контрольным) средствам массовой информации для соответствующего времени восстановления. Высота бара представляет среднее значение, а бары ошибок являются SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Этот протокол предназначен для определения защитных эффектов искусственных слезоточивых растворов против высыхания клеток. Первоначально клетки подвергаются воздействию сухих глазных капель, чтобы покрыть клетки. Далее, клетки сушатся, и метаболическая активность контролируется, чтобы оценить, могут ли формулировки смягчить пагубные последствия высыхания стресса. Эти шаги имеют решающее значение для понимания общего воздействия сухих глаз формулировки могут оказать на общую жизнеспособность роговицы эпителиальных клеток.

После того, как большинство сухих глазных составов будут удалены из культурных колодцев, химия оставшихся молекул, которые находятся в контакте с клетками, повлияет на высыхание клеток. Некоторые продукты содержат микро-эмульсии масел, которые сводят к минимуму испарениеклеток 20. Исследование, которое оценило анализ трения после полоскания показали поддержание низкого трения для некоторых сухих формулировок глаз, которые могут быть индикатором увеличения времени пребывания сухих глазформулировки 21. Одним из ограничений этого анализа является то, что, хотя защита от высыхания может быть оценена по сравнению с другими формулировками глазной капли продолжительность этой защиты не может быть определена из-за короткого времени сушки оценивается. Более длительное время сушки в этом анализе in vitro может потребовать использования многослойных культур, которые имеют общее больше содержания влаги, чем монослой клетки.

При изменениях значения температуры и влажности, возможно, потребуется скорректировать определенное время инкубации для составов на клетках и продолжительность времени сушки. Выбор температуры, RH и воздушного потока для моделирования условий экологического стресса, которые могут способствовать сухости глаз может быть трудно, как сезонные и местные экологические условия довольно переменной21. Современные камеры окружающей среды для человеческих исследований могут варьировать температуру от 5 до 35 градусов по Цельсию, и RH между 5% и 95%22. Используя эвапорометр и плотно оборудованные очки, было установлено, что при RH в 40-45% скорость испарения из роговицы составила 0,037мкл/см 2/мин,а при RH 20-25% скорость испарения составила 0,065 йл/см2/мин23. Если модель in vitro смотрит на защитный эффект формулировок в крайне низких условияхRH, таких как в самолетах 15,пустыни, или сухойвнутренней среде 16, инкубационные времена, возможно, потребуется сократить для размещения повышенных скорости испарения из клеток. В человеческой слезоточивой жидкости, различные липиды, полученные из мейбомиана и других желез присутствуют, которые защищают слезы от испарения. Эти липиды имеют различные точкиплавления 24. Изменения температуры могут повлиять на текучесть слезоточивой жидкости, поэтому тесты, проводимые при температуре окружающей среды, могут иметь значительно иные показатели испарения, чем тесты, проведенные при температуре 37 градусов по Цельсию. Так как средний диапазон температуры глазной поверхности составляет от 32,9 до 36градусов по Цельсию 25,проводить тест вблизи этого диапазона температур рекомендуется.

В дополнение к метаболическому красителю (alamarBlue), используемому в этом протоколе, существуют и другие химические реагенты, которые могут быть использованы для оценки влияния составов продукта на метаболическую активность клеток. Соли тетразолия (MTT, XTT, MTS, WST) являются альтернативными химическими веществами, которые могут быть использованы. Разница в соли тетразолия является то, что MTT является положительно заряженной молекулы, чтобы он может войти в цитоплазму живыхклеток 26. MTT становится неразрешимым после его сокращения NAD(P)H27. Она должна быть solubilized до чтения абсорбтора на пластине читателя. Другие соли тетразола отрицательно заряжены28. Они должны быть уменьшены вторичными молекулами вне живой клетки, потому что они не могут войти в клетку и взаимодействовать непосредственно с внутриклеточнымимолекулами 29. Для XTT, МТС и WST-1 анализы, добавление электронного агента связи 1-methoxy феназин methosulfate (PMS) может улучшить производительность анализов30. В отличие от метаболических анализов, которые используют тетразолий соли, alamarBlue не требует дополнительных растворимых или электронных агентов связи. Кроме того, в отличие от XTT, МТС или WST-1, alamarBlue проникает в клеточные мембраны и может быть уменьшена непосредственноклеточными ферментами 27,29. Прямое сравнение alamarBlue с солями тетразолия показало, что alamarBlue более чувствителен для оценки метаболической активности различных клеточныхлиний,включая HCEC3,27,31,32.

Другие биохимические конечные точки также могут быть рассмотрены для оценки защиты эпителиальных клеток роговицы человека путем высыхания. Флуоресцентные красители могут быть использованы для обнаружения проницаемости клеточных мембран и активности клеточнойестеразы 1. Кроме того, апоптоз может быть обнаружен путем окрашивания для апоптотических маркеров на поверхности клетки или путем измерения активностикаспаса 1,33. Другие анализы определили влияние офтальмологических продуктов на HCEC жесткие соединения34. Эти анализы могут быть включены в будущие оценки с использованием процедур высыхания, описанных в этой статье.

Есть много причин сухости глаз. Сухость глаза может быть вызвана снижением секреции слез, увеличением воспаления глазной поверхности или повышенным обезвоживанием глазной поверхности. Для людей, которые имеют испарительное сухое использование глаз сухой глазной капли, которая предотвращает их клетки от высыхания во время высыхания условиях может облегчить симптомы сухого глаза. Одной из проблем в некоторых сухих составах глаз является наличие консервантов, которые могут нанести вред глазной поверхности. Травмировать клетки не полезно для пациентов сухого глаза по мере того как оно может причинить больше клеток умереть по мере того как поврежденные клетки более впечатлительн к усилиювысыхания 35.

В недавней обзорной статье Garrigue et al.36 содержится оценка современных знаний о том, как действуют продукты на основе липидов для облегчения испарительного сухого глаза. Добавление липидов к липидным слезам может предотвратить испарение, тем самым защищая клетки от высыхания. Кроме того, гумектанты являются молекулами, которые привлекают и сохраняют воду на глазной поверхности37. И глицерин в растворе #1 и пропиленгликоль в растворе #3 являются гумектантами. Решение #3 показало больший защитный эффект HCEC, который, возможно, был связан с липидными и гумектантными свойствами ингредиентов состава.

Этот протокол предназначен для оценки метаболической активности HCEC после воздействия сухих составов глаз и высыхания стресса. Используя методы, описанные в этой статье, новые неиспытанные и защитные глазные капли могут быть разработаны для людей, которые страдают от испарительного сухого глаза.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Alcon за финансовую поддержку этих исследований.

Materials

75 cm2 Vented Flask Corning 354485 This is the BioCoat brand collagen coated
96 well plate costar 3370
alamarBlue Fisher Scientific dal 1025
Corning 48 Well plates Corning 354505 This is the BioCoat brand collagen coated
Cytation 5 BioTek CYT5MPV Can read fluorescence from 280 – 700 nm (for assay 540/590)
DMEM/F12 with L-glutamine and 15 mM HEPES Gibco 11039-021 There is No Phenol Red in this media
Fetal Bovine Serum Hycone SH30396.03
Human Corneal Epithelial Cells University of Ottawa N/A SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169–72.
Humidity/Temperature Chamber Associated Environmental Systems LH-1.5 Economy Line Humidity Chamber
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 100X concentration so add 1ml to each 99ml of media
Refresh Optive Advanced (solution #1) Allergan, Inc Carboxymethylcellulose Sodium (0.5%),Glycerin (1%),polysorbate 80 (0.5%),-Lubricants- Inactive ingredients-boric acid; carbomer copolymer type A; castor oil; erythritol; levocarnitine; purified water; Purite (stablized oxychloro complex)and may contain sodium hydroxide to adjust pH.
Soothe XP (solution #2) Bausch & Lomb Light mineral oil (1.0%), Mineral Oil (4.5%)-emolients-Inactive ingredients-boric acid, edetate disodium, octoxynol-40, polyquaternium-1 (preservative), polysorbate 80, purified water, sodium borate decahydrate. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide (to adjust pH).
Systane Complete (solution #3) Alcon Inc. Propylene Glycol 0.6% Lubricant Inactive ingredients- boric acid, dimyristoyl phosphatidylglycerol, edatate disodium, hydroxypropyl guar, mineral oil, polyoxl 40 stearate, POLYQUAD® (polyquaternium-1) 0.001% preservative, sorbitan tristearate, sorbitol and purified water. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide to adjust pH.
TrypLE Express (cell disassociation solution) Fisher Scientific 12605036
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
  2. Maurer, J. K., et al. Quantitative measurement of acute corneal injury in rabbits with surfactants of different type and irritancy. Toxicology and Applied Pharmacology. 158 (1), 61-70 (1999).
  3. Xu, M. L., McCanna, D. J., Sivak, J. G. Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).
  4. Slaughter, M. R., Bugelski, P. J., O’Brien, P. J. Evaluation of alamar blue reduction for the in vitro assay of hepatocyte toxicity. Toxicology in Vitro. 13 (4-5), 567-569 (1999).
  5. Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
  6. Paulsen, K., Maile, S., Giebel, J., Tost, F. Lubricating agents differ in their protection of cultured human epithelial cells against desiccation. Medical Science Monitor. 14 (6), 12-16 (2008).
  7. Tost, F., Keiss, R., Grossjohann, R., Jurgens, C., Giebel, J. Effect of different artificial tears against desiccation in cultured human epithelial cells. Medical Science Monitor. 18 (5), 188-192 (2012).
  8. Ubels, J. L., et al. Pre-clinical investigation of the efficacy of an artificial tear solution containing hydroxypropyl-guar as a gelling agent. Current Eye Research. 28 (6), 437-444 (2004).
  9. Hovakimyan, M., et al. Evaluation of protective effects of trehalose on desiccation of epithelial cells in three dimensional reconstructed human corneal epithelium. Current Eye Research. 37 (11), 982-989 (2012).
  10. Zheng, X., Goto, T., Shiraishi, A., Ohashi, Y. In vitro efficacy of ocular surface lubricants against dehydration. Cornea. 32 (9), 1260-1264 (2013).
  11. Matsuo, T. Trehalose protects corneal epithelial cells from death by drying. British Journal of Ophthalmology. 85 (5), 610-612 (2001).
  12. Zheng, Q., et al. Reactive oxygen species activated NLRP3 inflammasomes initiate inflammation in hyperosmolarity stressed human corneal epithelial cells and environment-induced dry eye patients. Experimental Eye Research. 134, 133-140 (2015).
  13. Hua, X., et al. Protective Effects of L-Carnitine Against Oxidative Injury by Hyperosmolarity in Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5503-5511 (2015).
  14. Schulze, U., et al. Trefoil factor family peptide 3 (TFF3) is upregulated under experimental conditions similar to dry eye disease and supports corneal wound healing effects in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 3037-3042 (2014).
  15. Giaconia, C., Orioli, A., Di Gangi, A. Air quality and relative humidity in commercial aircrafts: An experimental investigation on short-haul domestic flights. Building and Environment. 67, 69-81 (2013).
  16. van Setten, G., Labetoulle, M., Baudouin, C., Rolando, M. Evidence of seasonality and effects of psychrometry in dry eye disease. Acta Ophthalmologica. 94 (5), 499-506 (2016).
  17. Valtink, M., Donath, P., Engelmann, K., Knels, L. Effect of different culture media and deswelling agents on survival of human corneal endothelial and epithelial cells in vitro. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (2), 285-295 (2016).
  18. Zachari, M. A., et al. Evaluation of the Alamarblue Assay for Adherent Cell Irradiation Experiments. Dose-Response. 12 (2), 246-258 (2014).
  19. Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
  20. Benelli, U. Systane lubricant eye drops in the management of ocular dryness. Clinical Ophthalmology. 5, 783-790 (2011).
  21. Davis, R. E., McGregor, G. R., Enfield, K. B. Humidity: A review and primer on atmospheric moisture and human health. Environmental Research. 144 (Pt A), 106-116 (2016).
  22. Calonge, M., et al. Controlled Adverse Environment Chambers in Dry Eye Research. Current Eye Research. 43 (4), 445-450 (2018).
  23. McCulley, J. P., Uchiyama, E., Aronowicz, J. D., Butovich, I. A. Impact of evaporation on aqueous tear loss. Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 121-128 (2006).
  24. Bron, A. J., Tiffany, J. M., Gouveia, S. M., Yokoi, N., Voon, L. W. Functional aspects of the tear film lipid layer. Experimental Eye Research. 78 (3), 347-360 (2004).
  25. Purslow, C., Wolffsohn, J. S. Ocular surface temperature: a review. Eye & Contact Lens. 31 (3), 117-123 (2005).
  26. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
  27. Stockert, J. C., Horobin, R. W., Colombo, L. L., Blazquez-Castro, A. Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives. Acta Histochemica. 120 (3), 159-167 (2018).
  28. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  29. Rampersad, S. N. Multiple Applications of Alamar Blue as an Indicator of Metabolic Function and Cellular Health in Cell Viability Bioassays. Sensors. 12 (9), 12347-12360 (2012).
  30. Li, J., Zhang, D. L., Ward, K. M., Prendergast, G. C., Ayene, I. S. Hydroxyethyl disulfide as an efficient metabolic assay for cell viability in vitro. Toxicology in Vitro. 26 (4), 603-612 (2012).
  31. Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells. Cytotechnology. 68 (4), 1489-1498 (2016).
  32. Uzunoglu, S., et al. Comparison of XTT and Alamar blue assays in the assessment of the viability of various human cancer cell lines by AT-101 (-/- gossypol). Toxicology Mechanisms and Methods. 20 (8), 482-486 (2010).
  33. McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), a026716 (2015).
  34. McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
  35. Puhlev, I., Guo, N., Brown, D. R., Levine, F. Desiccation tolerance in human cells. Cryobiology. 42 (3), 207-217 (2001).
  36. Garrigue, J. S., Amrane, M., Faure, M. O., Holopainen, J. M., Tong, L. Relevance of Lipid-Based Products in the Management of Dry Eye Disease. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 33 (9), 647-661 (2017).
  37. Lievens, C., et al. Evaluation of an enhanced viscosity artificial tear for moderate to severe dry eye disease: A multicenter, double-masked, randomized 30-day study. Contact Lens & Anterior Eye. 42 (4), 443-449 (2019).

Tags

Corneal Epithelial CellsDesiccationArtificial Tear FormulationsMetabolic ActivityCell CultureCell Viability AssayFluorescence Measurement

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Rangarajan, R., Ketelson, H. A., Do, R., McCanna, D. J., Suko, A., Enstone, D., Subbaraman, L. N., Dantam, J., Jones, L. W. Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation. J. Vis. Exp. (159), e60812, doi:10.3791/60812 (2020).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image