포유류 조직과 콜레스테롤을 함유한 제노푸스 우세포의 농축

콜레스테롤, 주요 세포 지질, 수많은 중요 한 기능 및 구조적 역할을 한다^{1,,2,,3,,44,5,,6,,7,,8,,9.} 혈장 막의 물리적 특성을 조절하는 것에서부터 세포 생존력, 성장, 증식, 그리고 생화학적 경로의 과다에서 신호 및 전구체 분자역할을 하는 것까지, 콜레스테롤은 정상적인 세포 및 장기 기능에 필수적인 구성 요소입니다. 결과적으로, 콜레스테롤 결핍은 가혹한 물리적 기형 및 무질서의 각종 귀착됩니다. 한편, 생리적 수준(2-3x)을 초과하는 콜레스테롤의 작은 증가도 세포독성^1,,2,,10 및 심혈관^{11,12, 13및13} 신경퇴행성 질환^{14,,15,,16,,17을}포함하는 질환의 발달과 연관되어 있다.^, 따라서, 콜레스테롤의 중요한 기능을 심문하고 콜레스테롤 수치의 변화의 효과를 결정하기 위해, 조직, 세포 및 제노푸스 난모세포에서 콜레스테롤의 함량을 변화시키는 다른 접근법이 개발되었다.

포유류 조직 및 세포에 있는 콜레스테롤 수치의 변경
몇몇 접근은 조직과 세포에 있는 콜레스테롤의 수준을 감소시키기 위하여 이용될 수 있습니다^18. 1개의 접근은 콜레스테롤 합성^19,,20의비율을 통제하는 HMG CoA 환원효소를 억제하기 위하여 지단백질 결핍 혈청에 용해된 스타틴에 그들의 노출을 관련시킵니다. 그러나, 이러한 콜레스테롤 낮추는 약물 또한 mevalonate 통로 따라 비 스테롤 제품의 형성을 억제. 따라서, 소량의 메발로네이트(mevalonate)가 첨가되어 이들^{제품(21)의} 형성을 허용하고 이러한 접근법의 특이성을 강화한다. 콜레스테롤 수치를 감소시키는 또 다른 접근은 β-cyclodextrins의 사용을 관련시킵니다. 이러한 글루카피라노스 단량체는 스테롤^(22)의크기와 일치하는 직경의 내부 소수성 공동을 가지고 있어 세포에서 콜레스테롤을 추출하여 기본 콜레스테롤 함량^23에서고갈시됩니다. 일례로 는 2-하이드록시프로필-β-시클로덱스트린(HPβCD)이 있으며, 현재 니만-픽 타입 C질환의 치료를 위해 시험중인 전임상 약물로, 리소좀 콜레스테롤 저장을 특징으로 하는 유전적 유전적 치명적인 대사^{장애(24)이다.} 콜레스테롤 고갈의 수준은 사용된 특정 유도체에 달려 있습니다. 예를 들어, HPβCD는 메틸화 유도체보다 낮은 용량을 가진 콜레스테롤을 추출하며, 메틸-β-시클로덱스트린(MβCD)^{24,,25,,26,,27,,28,,29,,30.} 특히, 그러나, β-cyclodextrins는 또한 콜레스테롤 이외에 그밖 소수성 분자를 추출할 수 있습니다, 그 때 비특이적인 효력³¹귀착될 수 있는. 고갈과는 대조적으로, 세포와 조직은 콜레스테롤^23로포화 된 β-cyclodextrin치료를 통해 콜레스테롤을 구체적으로 풍부하게 할 수 있습니다. 이러한 접근법은 또한 콜레스테롤^{고갈(31)에}사용되는 β-사이클로덱스트린의 특이성에 대한 대조군으로서 사용될 수 있다. 조직 및 세포로부터의 콜레스테롤 고갈은 간단하고 세포를 저장하는 데 사용되는 배지에 용해된 30-60분 내지 5 mMMMMMΒCD에 대한 세포를 노출시킴으로써 달성될 수 있다. 이 접근법은 콜레스테롤 함량이 50% 감소할 수 있습니다(예를 들어, 해마 뉴런^32,쥐 대뇌 동맥^33). 한편, 조직 및 세포의 콜레스테롤 농축을 위한 β-사이클로덱스트린-콜레스테롤 복합체를 준비하는 것은 더 복잡하고, 프로토콜 섹션에서 설명될 것이다.

콜레스테롤포화 β-cyclodextrin를 사용하여 조직 과 세포를 풍부하게하는 대안 적인 접근은 조직/세포에 표현된 LDL 수용체에 의존하는 LDL의 사용을 관련시킵니다^18. 이 접근법은 세포의 천연 콜레스테롤 항상성 기계를 사용하는 이점을 제공하지만, 몇 가지 한계가 있다. 첫째, LDL 수용체를 발현하지 않는 조직 및 세포는 이 접근법을 사용하여 농축될 수 없다. 둘째, LDL 입자는 콜레스테롤 이외에 다른 지질을 포함. 구체적으로, LDL은 단백질 아포B₁₀₀ 100(25%)으로 구성된다. 및 다음 지질 (75 %): ~ 6-8 % 콜레스테롤, ~ 45-50 % 콜레스테릴 에스테르, ~ 18-24 % 인지질, 및 ~ 4-8 % 트리 아실 글리세롤^34. 따라서, LDL 입자를 통한 콜레스테롤의 전달은 비특이적이다. 셋째, LDL 수용체를 발현하는 조직 및 세포에서 LDL에 의한 콜레스테롤 함량 증가의 비율은 콜레스테롤포화 사이클로덱스트린을 사용하여 관찰된 증가보다 현저히 낮을 수 있다. 예를 들어, 이전 연구에서, LDL을 통해 콜레스테롤설치류 대뇌 동맥의 농축만 결과 10-15% 콜레스테롤 수치에 증가^35. 대조적으로, 프로토콜 섹션에 설명된 바와 같이 콜레스테롤포화사이클로덱스트린을 가진 이들 동맥의 농축은 콜레스테롤 함량의 >50% 증가를 초래하였다(대표 결과 섹션, 그림 1참조).

제노푸스 난소에서 콜레스테롤 수치의 변화
제노푸스 난모세포는 세포 및 단백질 기능을 연구하는 데 일반적으로 사용되는 이종 발현 시스템을 구성합니다. 이전 연구는 제노푸스 난모세포에서 인지질 대구치 비율에 콜레스테롤이 0.5 ±0.1^36임을보여주었다. 콜레스테롤의 이 본질적인 높은 수준으로 인해, 이 시스템에서 콜레스테롤의 내용을 증가 하는 것은 도전, 아직 막 인지질과 콜레스테롤에서 만든 분산을 사용 하 여 달성 될 수 있다. 우리가 이 목적을 위해 선택한 인지질은 인공 평면 지질 이중층을 형성하기 위해 사용된 것과 유사하며 프로토콜 섹션에 설명된 바와 같이 L-α-phosphatidyleolamine (POPE) 및 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-phopho-l-serine (POPS)를 포함합니다. 이 접근법은 콜레스테롤 함량이 >50% 증가할 수 있습니다(대표 결과 섹션, 그림 2참조).

인지질 기반 분산으로 제노푸스 난모세포를 풍부하게하는 대체 접근법은 조직과 세포가 농축되는 방식과 유사한 콜레스테롤로 포화 된 사이클로 덱스트린을 사용하는 것을 포함합니다. 그러나, 우리는 낮은 재현성과 효율성의 이 접근이, 콜레스테롤 내용에 있는 ~25% 증가의 평균으로 찾아냈습니다. 이는 이러한 두 가지 접근 방식의 로딩 용량이 다르기 때문일 수 있습니다(대표 결과 섹션, 그림 3참조). 대조적으로, 제노푸스 난모세포에서 콜레스테롤을 고갈시키기 위하여 cyclodextrin를 사용하여 콜레스테롤 내용에서 ~40% 감소귀착될 수 있다는 것을 보여주었습니다^36.

여기에서는 콜레스테롤로 포화된 사이클로덱스트린과 리포좀을 이용한 제노푸스 난모세포의 적용을 통해 포유류 조직과 세포의 콜레스테롤 농축에 초점을 맞추고 있습니다. 두 접근 은 단백질 기능에 콜레스테롤의 증가 된 수준의 효과 설명 하기 위해 활용 될 수 있다. 단백질 기능의 콜레스테롤 변조의 메커니즘은 직접적인 상호 작용을 포함 할 수있다⁸ 및 / 또는 간접 효과⁹. 콜레스테롤이 직접적인 상호 작용을 통해 단백질 기능에 영향을 미칠 때, 단백질 활동에 대한 콜레스테롤 수치의 증가의 효과는 세포 유형, 발현 시스템 또는 농축 접근법과 는 무관합니다. 예를 들어, 이러한 두 가지 접근법을 활용하여 심방 근세포^37,해마 뉴런^32,,38,HEK293³⁹ 세포, 제노푸스 난모세포^32,,37로발현된 내측 정류 칼륨(GIRK) 채널에 대한 콜레스테롤의 효과를 결정하였다. 이러한 연구에서 얻은 결과는 일관되었다: 포유류 세포의 모든 세 가지 유형과 양서류 콜레스테롤 upregulated GIRK 채널 기능 (참조 대표 결과 섹션, 그림 4,해마 뉴런 및 제노푸스 oocytes에 해당 실험). 더욱이, 이들 연구에서 이루어진 관찰은 또한 심방 근세포^37,,40 및 해마 뉴런^{32,,38마리가} 고콜레스테롤 식이요법을 행한 동물로부터 신선하게 분리된 연구 결과와 일치하였다.⁴⁰ 특히, MβCD를 이용한 해마 뉴런의 콜레스테롤 농축은 콜레스테롤 수치와 GIRK 기능 모두에 높은 콜레스테롤 식이요법의 영향을 해결하는 데 사용되는 아토르바스타틴 치료의 효과를 역전시켰다^38. 다른 연구에서는, 우리는 제노푸스 난모세포와 HEK293 세포^41을모두 사용하여 내적으로 정류칼륨 채널 Kir2.1의 콜레스테롤 감도에 돌연변이의 효력을 조사했습니다. 다시, 채널의 감도에 대한 돌연변이의 효과는 두 시스템에서 유사하였다.

분자에 높은 콜레스테롤 수치의 영향을 결정 하기 위한 두 농축 방법의 응용 프로그램, 세포, 그리고 장기 기능 은 수많은. 특히, 세포와 조직을 풍부하게 하기 위해 사이클로덱스트린-콜레스테롤 복합체의 사용은 그 특이성 때문에 크게 일반적이다. 이러한 접근법의 최근 예로는 HERG 채널 활성화 및 기본 메커니즘에 대한 콜레스테롤의 영향의 측정^42,고슴도치 신호^전달을촉진하기 위해 스무딩된 G 단백질 결합 수용체를 활성화시키는 발견, 및 줄기 세포 생체역학 및 포막 관련 링커 단백질을 통한 지방형성에서콜레스테롤의 역할의 식별^44. 우리 자신의 연구에서, 우리는 MβCD와 포유류 조직 농축을 활용 :콜레스테롤 복합체는 혈관 평활근^{35, 45,}46에서 칼슘의 기본 기능 및 전압 게이트 채널의 약리학적 프로필과 칼슘의 약리학적 프로필에 대한 콜레스테롤 농축의 효과를 연구하기 위해^35,45,,46. 다른 연구에서는 콜레스테롤을 가진 제노푸스 난모세포를 풍부하게 하기 위한 인지질 계 분산 접근법을 사용하여 콜레스테롤 민감도^{41,,47,,48,,49에서}KirK 채널에서 다른 부위의 역할을 결정하고 이들 채널에서 콜레스테롤 결합 부위를 결정할 뿐만 아니라^32,50,,51.,