Analyse de méthylation LINE-1 dans les cellules souches mésenchymales traitées avec des vésicules extracellulaires dérivées de l'ostéosarcome
Summary
Décrit ici est l’utilisation d’une méthode d’amplification de sonde méthylation-spécifique pour analyser des niveaux de méthylation des éléments de LIGNE-1 dans les cellules souches mésenchymales traitées avec des vésicules extracellulaires ostéosarcoma-dérivées. L’ultracentrifugation, une procédure populaire pour séparer les vésicules extracellulaires du sérum bovin foetal, est également démontrée.
Abstract
L’amplification de sonde spécifique à la méthylation (MSPA) est une technique simple et robuste qui peut être utilisée pour détecter les différences relatives dans les niveaux de méthylation des échantillons d’ADN. Il est débrouillard, nécessite de petites quantités d’ADN, et prend environ 4 à 5 h de travail pratique. Dans la technique présentée, les échantillons d’ADN sont d’abord dénaturés puis hybridés en sondes qui ciblent l’ADN à des sites méthylés ou de référence comme un contrôle. L’ADN hybride est séparé en réactions parallèles, l’une subissant seulement la ligature et l’autre subissant la ligature suivie de la digestion HhaI-négociée aux séquences non méthylées de GCGC. Les fragments d’ADN qui en résultent sont amplifiés par PCR et séparés par l’électrophorèse capillaire. Les sites GCGC méthylés ne sont pas digérés par HhaI et produisent des signaux de pointe, tandis que les sites GCGC non méthylés sont digérés et aucun signal de pointe n’est généré. La comparaison des pics normalisés de contrôle des versions digérées et non digérées de chaque échantillon fournit le rapport de dosage de méthylation d’un échantillon d’ADN. Ici, MSPA est utilisé pour détecter les effets des vésicules extracellulaires dérivées de l’ostéosarcome (VE) sur le statut de méthylation de l’élément nucléaire entrecoupé à long (LINE-1) dans les cellules souches mésenchymales. Les LINE-1 sont des éléments d’ADN répétitifs qui subissent généralement une hypométhylation dans le cancer et, à ce titre, peuvent servir de biomarqueur. L’ultracentrifugation est également utilisée comme méthode rentable pour séparer les vésicules extracellulaires des fluides biologiques (c.-à-d. lors de la préparation du sérum bovin fœtal appauvri par les véhicules électriques [FBS] et de l’isolation des VE à partir des médias conditionnés par l’ostéosarcome [centrifugation différentielle]). Pour l’analyse de méthylation, les sondes LINE-1 personnalisées sont conçues pour cibler trois sites de méthylation dans la séquence de promoteur LINE-1 et sept sites de contrôle. Ce protocole démontre l’utilisation de MSPA pour l’analyse de méthylation LINE-1 et décrit la préparation de LA SF APPAUVRIe par ultracentrifugation.
Introduction
La méthylation de l’ADN est une modification épigénétique majeure qui se produit dans les cellules humaines. La méthylation de l’ADN fait référence au lien entre les groupes méthyliques et les résidus de cytosine dans les dinuccléotides du CpG. De tels dinucleotides se trouvent habituellement dans les grappes (îles CpG) à la région de 5′ des gènes1. Dans les cellules normales, la plupart de ces dinucléotides existent dans un état non méthylé, ce qui permet la transcription de l’ADN. Incidemment, de nombreux cancers sont associés à des îles cpG hyperméthylées et au silençage transcriptomique2, en particulier dans les gènes suppresseurs de tumeurs, qui à leur tour contribuent à diverses caractéristiques du cancer3.
D’autre part, les éléments nucléaires entrecoupés de longue durée-1 (LINE-1 ou L1) sont des éléments d’ADN répétitifs et transposables qui ont normalement des niveaux élevés de méthylation dans les îles CpG. La méthylation de LINE-1 empêche la translocation et aide à maintenir l’intégrité du génome. Dans plusieurs types de cancer, LINE-1 est hypométhylé, ce qui entraîne l’activation et l’instabilité chromosomique rétrotransposition-négociée subséquente4. LINE-1 représente près de 17% du génome humain5, et son statut de méthylation peut servir d’indicateur des niveaux de méthylation génomique mondiale6. L’hypométhylation globale de LINE-1 est considérée pour précéder la transition des cellules à un phénotype de tumeur7; par conséquent, il est prometteur comme marqueur potentiel pour l’début précoce du cancer.
Actuellement, il existe plusieurs méthodes pour l’analyse de la méthylation, y compris le pyrosequencing, la méthylation spécifique PCR, microarrays, et l’immunoprécipitation de chromatine1. L’utilisation du séquençage de nouvelle génération a également permis d’intégrer des approches à l’échelle du génome pour la détection de la méthylation de l’ADN. Bon nombre de ces méthodes reposent sur l’ADN traité au bisulfite, dans lequel les cytosines non méthylées sont converties en uracil et les cytosines méthylées restent inchangées. Cependant, le travail avec l’ADN bisulfite-traité a plusieurs pièges, tels que les conversions incomplètes des cytosines unmethylées à l’uracil, l’amplification biaisée des séquences, et les erreurs de séquençage8.
Dans l’amplification de sonde méthylation-spécifique (MSPA), les sondes composées de deux oligonucléotides ciblent des séquences d’ADN contenant un emplacement de restriction (GCGC) pour l’enzyme de restriction méthylation-sensible HhaI9. Une fois que les sondes s’hybrident à l’ADN, chaque échantillon est divisé en deux ensembles. Les sondes dans le premier ensemble subissent une ligature, tandis que les sondes dans le deuxième ensemble subissent une ligature suivie d’une digestion Médiée par HhaI sur les sites CGCG non méthylés. Les deux ensembles d’échantillons sont ensuite amplifiés par PCR, et les produits sont séparés par l’électrophorèse capillaire. Les sondes sur les sites non méthylés sont digérées par HhaI et ne sont pas amplifiées pendant le PCR, ce qui n’entraîne aucun signal de pointe. En revanche, les sondes sur les sites méthylés sont protégées de la digestion et sont donc amplifiées pendant pcR, générant par la suite des signaux de pointe10.
MSPA a plusieurs avantages par rapport aux méthodes alternatives. Tout d’abord, il nécessite une faible quantité d’ADN (50 à 100 ng) et est bien adapté pour l’analyse de l’ADN à partir d’échantillons de paraffine fixée parlinanine formaline10. Il ne nécessite pas d’ADN bisulfite-traité; en fait, il est impropre à l’ADN qui est modifié de cette façon. De nombreux échantillons peuvent être analysés en même temps, et les sondes MSPA peuvent être conçues de telle sorte qu’elles ciblent plusieurs gènes ou séquences simultanément. En outre, les sondes sont spécifiques et sensibles pour l’ADN méthylé que le site de restriction HhaI correspond à une séquence qui est typique des îles CpG10.
Cette étude a étudié les effets des vésicules extracellulaires (VES) dérivées de l’ostéosarcome (OS) sur la méthylation LINE-1 dans les cellules souches mésenchymales dérivées du tissu adipeux (AT-MSCs; Figure 1). Les véhicules électriques sont des vésicules à l’échelle nanométrique et membranaire sécrétées par la plupart des types de cellules. Ils transportent des protéines, des lipides, de l’ARNm, des microARN et des molécules supplémentaires provenant des cellules parentes11,12. Les véhicules électriques jouent la médiation de la communication intercellulaire et jouent des rôles importants dans plusieurs conditions pathophysiologiques13,14. Une étude récente a montré que les véhicules électriques dérivés du cancer peuvent transférer le LINE-1 actif aux cellules receveuses15. Il a été rapporté plus tôt que les véhicules électriques de la lignée cellulaire HOS-143B peuvent modifier le statut de méthylation de LINE-1 dans les MSC, en plus d’autres effets génétiques16.
Lors de la culture des cellules pour l’isolement des véhicules électriques, il est important d’utiliser le sérum bovin fœtal appauvri par les véhicules électriques dans le milieu de croissance, puisque les véhicules électriques dérivés du FBS peuvent interférer avec les véhicules électriques provenant d’autres sources et entraver les résultats17,18. L’ultracentrifugation est l’une des méthodes les plus courantes pour épuiser les véhicules électriques de FBS. Il s’agit d’une procédure relativement simple et rentable par rapport à des alternatives telles que l’ultrafiltration et commerciale EV-appauvri FBS19. Ici, le protocole montre également comment préparer EV-appauvri FBS par ultracentrifugation.
Cet article présente un protocole détaillé pour les techniques susmentionnées, de l’isolement des véhicules électriques d’une lignée cellulaire OS à l’analyse de méthylation de LINE-1 dans les MSC traités PAR OS-EV (Figure 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette étude illustre comment MSPA peut être utilisé pour détecter et quantifier le statut de méthylation d’un élément génétique spécifique. LINE-1 a été l’objet ici, mais les sondes peuvent être conçues pour cibler une gamme de gènes et de séquences. En outre, il existe une liste croissante de mélanges de sondes disponibles pour différentes applications. MSPA est une technique simple et robuste pour l’analyse de méthylation de l’ADN qui ne nécessite pas de conversion bisulfite10</sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par le financement du projet de l’Université d’Helsinki (WBS490302, WBS737141112) du financement de l’Hôpital universitaire d’Helsinki pour la recherche en santé au niveau universitaire (Y1014SUL05, TYH2016130), la Fondation médicale finno-norvégienne et la Fondation médicale finno-norvégienne, et Fonds Maja-Lisa Selander (Fondation Minerva). Nous remercions Walter Pavicic d’avoir fourni le protocole MSPA modifié et du soutien technique connexe. Nous sommes reconnaissants à Teemu Masalin (Université d’Helsinki) de nous avoir aidés avec la production vidéo.
Materials
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14×95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
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