レジオネラ肺球菌ドット/Icm分泌系の空間的特徴を解決するためのライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の適用
Summary
細菌細胞のイメージングは、大きな高分子機械の機能を決定する静的および動的プロセスの定義に焦点を当てた新しいシステム生物学アプローチです。ここでは、定量的ライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の統合により、レジオネラ菌型肺炎球体系IV型分泌系のアーキテクチャと機能を研究しています。
Abstract
レジオネラ・ニューモフィルのドット/Icm分泌系は、細菌極で局所化し、タンパク質およびDNA基質を標的細胞に送達する複雑なIV分泌系(T4SS)ナノマシンであり、一般的に直接細胞間接触を必要とするプロセスである。我々は最近、凍結電子断層撮影(cryo-ET)によってドット/Icm装置の構造を解明し、細胞質複合体に接続する細胞エンベロープスパンチャネルを形成することを示した。生きた細胞とcryo-ETにおける蛍光顕微鏡法を用いて、試料のネイティブ構造を保存する2つの相補的アプローチを適用することで、タンパク質の可視化と、他のDot/Icmサブユニットに対する各機械成分の生産時期と同化をその時点で可能にします。極位置の要件を調べ、T4SS機械生物発生に関連する動的特徴を特徴付けるために、染色体上のネイティブ位置でスーパーフォルダグリーン蛍光タンパク質をドット/Icm ATPase遺伝子にコードする遺伝子を融合しました。以下の方法は、生体細胞の定量的蛍光顕微鏡とcryo-ETを統合し、これらのタンパク質の細胞内の極地の局在、ダイナミクス、および構造を定量化します。レジオネラ・ニューモフィラT4SSを研究するためにこれらのアプローチを適用することは、ドット/Icmシステムの機能を特徴付けるために有用であり、T4SSまたは他のタイプの細菌分泌複合体を利用する多種多様な細菌病原体を研究するために適応することができる。
Introduction
レジオネラ菌(L.肺炎球菌)は、レジオネラ症の病因である淡水貯留層に生息し、水生自由水泳原生動物の中で細菌が感染して複製することによって増殖する。L. 気球菌は、飲料水源からのエアロゾル化細菌の吸入が発生すると、ヒトで病気の発生を引き起こす。感染した細胞では、宿主経路の転覆により、L.肺炎球菌は、それが存在する液胞のエンドサイト成熟を遅らせ、細菌複製をサポートする細胞コンパートメントの生生生成を促進することができる。このプロセスは、Dot/Icmとして知られている特殊な細菌タイプIVB分泌システム(T4BSS)と、感染中に宿主サイトゾルに転化される300以上の「エフェクター」タンパク質のレパートリーによって駆動され、細胞機能1、2、3、4、5の操作を容易にする。機能的なDot/Icm装置を欠いている変異体は、宿主サイトゾルにエフェクターを送達できず、細胞内複製に欠陥があり、疾患6,7の動物モデルにおいてアビリエントである。
多くの細菌種は、感染プロセスに必要な非常に複雑で動的なマルチコンポーネントマシンを開発してきました。Dot/Icmシステムのような他のT4BSSも、コクシエラ・ブルネティやリケッチエラ・グリリなどの細菌病原体の細胞内複製に不可欠である。T4BSSは、DNAの伝達を媒介し、エフェクタータンパク質の限られたレパートリーを提供できる原型型IVA系と進化的に関連していますが、Dot/Icmシステムは機械成分のほぼ2倍を有し、多種多様なエフェクターを提供します。おそらく、コンポーネント数のこの拡大は、Dot / Icm装置が新しいエフェクタを容易に8,9に収容し、統合することを可能にしました。
我々は最近、クライオ電子断層撮影(cryo-ET)を使用して、その場でドット/Icm装置の構造を解き、細胞質複合体に接続する細胞エンベロープスパンチャネルを形成することを示した。さらなる分析は、細胞体ATPase DotOとの相互作用を通じて、細胞内のTPCとの関連がL.ニューモフィラ細胞極のドット/Icm系と関連することを明らかにした。DotBは、ほとんどの細菌細胞に細胞間運動を示すことを発見し、このATPaseが動的な細胞構造集団に存在するが、極性ドット/Icm複合体にも関連していることを示している。さらに、DotOは、内膜複合体に関連するDotOダイマーの六方体集合体を形成し、この細胞質複合体の基部にDotBヘキサマーが結合する。DotB-DotOエネルギー複合体のアセンブリは、T4SS(図1)10を介して基板の転座を指示する細胞質チャネルを作成する。
これらの最近の進歩にもかかわらず、Dot/Icmシステムがどのように機能し、各タンパク質がどのように組み立てて活性装置8を形成するかについてはほとんど知られていない。Dot/Icm T4SSの制御回路を明らかにすることは、宿主と病原体の相互作用の分子メカニズムを理解する上で重要です。そこで、スーパーフォルダGFP(sfGFP)でタグ付けされた必須L.肺炎球菌ドット/Icmシステムコンポーネントを検出し、特徴付けるために、生細胞顕微鏡とcryo-ETを使用する方法について説明します。定量的蛍光顕微鏡を用いて、DotBの極地局在化は野生型のバックグラウンドで、またはタイプIV系が削除されたときに定義される。タイムラプス顕微鏡は、ドット/Icm細胞体ATPases間の局在およびダイナミクスの違いを定量化するために使用されます。
ライブイメージングやクライオETなどの2つの相補的アプローチを組み合わせることで、他のインビトロシステムと比較して利点があります。両方の方法は無傷の細胞で行われ、T4BSSの自然環境を維持し、サンプル調製中のネイティブ構造の破壊を最小限に抑えます。タンパク質の過剰発現は分泌装置の染色法を損なう可能性があるため、sfGFP融合は、各融合が単一コピーでコードされ、発現が内因性プロモーターによって駆動されるように、レジオネラ染色体へのアレジオン交換を介して返される。染色体でコード化された融合の可視化により、定義された時点で発現しているタンパク質の正確なレベルを定量化することができます。Cryo-ETには、分泌システムの構造を決定するための多くの利点があります。最も顕著な利点は、cryo-ETサンプルが細菌細胞アーキテクチャの文脈で天然複合体を保存する凍結された無傷の細胞で構成されているということです。その結果、cryo-ETは、膜複合体を抽出し、コア装置から末梢タンパク質を取り除くか、または全体的な構造を変更することができる生化学的精製アプローチよりも好ましい場合があります。さらに、関心のあるタンパク質にsfGFPなどのかさばるタンパク質をタグ付けすると、cryo-ETによって検出可能な質量が追加され、Dot/Icm装置の異なるサブコンプレックスをcryo-ETによって得られた構造にマッピングするのに役立ちます。
このアプローチは、細菌細胞膜に組み立てる多分子複合体に関する構造情報を明らかにするための強力なツールです。これらの手法を用いて解明された構造の解釈は、T4BSS コンポーネントの機能、機能に必要なコンポーネントの数、コンポーネントの相互作用、およびこれらの機能を理解するのに役立ちます。サブアセンブリが実行されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
細菌分泌系の機能を解明することは、宿主と病原体の相互作用を完全に理解する鍵です。分泌系は、エフェクタータンパク質を宿主細胞に注入できる複雑な機械であり、場合によっては細菌複製をサポートする細胞内ニッチの確立を促進する。上記の方法は、呼吸器病原体レジオネラ肺炎球菌のDot/Icm分泌システムを研究するための重要な新しいツールを提供し、病原性に不可欠なエフ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.C.とC.R.R.はNIH(R37AI041699およびR21AI130671)によってサポートされました。D.P.、B.H.、J.Lは国立衛生研究所(R01AI087946およびR01GM107629)によって支援されました。
Materials
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7×2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
References
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