אנו מציגים שיטה המשלבת טיהור חלבון ממברנה והחוקה לתוך peptidiscs בצעד כרומטוגרפי יחיד. מקפלים ביולוגיים משמשים להחזקה ישירה של פני השטח ולמדידה של מדידת חלבונים ואינטראקציות באמצעות האינטרפרומטריה.
חלבונים ממברנות, כולל מובילי, ערוצים, וקולטנים, מהווים כמעט רבע של פרוטאום הסלולר ויותר ממחצית מטרות התרופה הנוכחית. ובכל זאת, המכשול העיקרי לאפיון ולניצול שלהם בהגדרות אקדמיות או תעשייתיות הוא האסטרטגיות הביוכימיות, הביופיזיקלי והתרופות מחייבות את החלבונים האלה להיות במצב מסיס למים. המעבדה שלנו פיתחה לאחרונה peptidisc, הממברנה מיטיסי מציע “בגודל אחד מתאים לכולם” גישה לבעיה של מסיסות חלבון ממברנה. אנו מציגים כאן פרוטוקול יעיל המשלב טיהור חלבון ו peptidisc מחדש החוקה בשלב כרומטוגרפי יחיד. זרימת עבודה זו, כינה את PeptiQuick, מאפשרת לעקוף דיאליזה ודגירה עם מחרוזות פוליסטירן, ובכך מפחיתה באופן משמעותי את החשיפה לחומר ניקוי, חלבון הדנטורציה, ואובדן לדוגמה. כאשר PeptiQuick מבוצעת עם מקפלים פיגומים ביולוגיים, ההכנה יכולה להיות מחוברת ישירות למשטחים מצופים בstreptavidin. אין צורך biotinylate או לשנות את המטרה חלבון הממברנה. Peptiquick הוא לראווה כאן עם קולטן קרום fhua ו מיקרוביאלית ליגנד colicin M, באמצעות הפרעות ביואולייר כדי לקבוע את הקינטיקה המדויקת של האינטראקציה שלהם. המסקנה היא כי PeptiQuick היא דרך נוחה להכין ולנתח חלבון ממברנה-ליגניות ואינטראקציות בתוך יום אחד בסביבה נטולת כביסה.
חלבונים ממברנה מושמטים לעתים קרובות מפני מחקר של תרופות או נוגדנים גילוי מחקרים בשל הנטייה של חלבונים הממברנה לצבור מחוץ לסביבה bilayer ליפיד, במיוחד בנוכחות של דטרגנטים1. לכן, בשנים האחרונות, מספר mimetics ממברנה (כינה את הפיגומים) פותחו כדי להקל על הבידוד והחקירה של חלבונים ממברנה בסביבה ללא חומרי ניקוי לחלוטין (כלומר, ננודיסקי, SMALPs, אמפיפולים, וכו ‘) . שתיים,שלוש,ארבע,חמש,שש עם זאת, החוקה של חלבונים ממברנות אלה mimetics לעתים קרובות דורש אופטימיזציה נרחבת, אשר צורכת זמן ובדרך כלל מלווה עם אובדן של חלבון שחזור7,8. כדי להתגבר על מגבלות אלה, המעבדה שלנו פיתחה לאחרונה “בגודל אחד מתאים” ניסוח המכונה peptidisc9. הפטיפדיסק נוצר כאשר מספר עותקים של מעצב 4.5 kDa מעוצב באמצעות פפטיד ביהליינית מאוגד למשטח ההידרופובי של חלבון ממברנה מטרה. החוקה היציבה של peptidisc מתרחשת בעת הסרת אבקת כביסה, להפוך שומנים אנדוגניים וחלבונים ממברנה מסיסות לתוך חלקיקים מסיסים במים. החלקיקים האלה מיוצבים. עכשיו ליישומים רבים במורד הזרם
שיטת peptidisc מציעה מספר יתרונות; לדוגמה, החוקה היא פשוטה, מאז הכריכה של הפיגומים peptidisc על היעד מונחה על ידי תבנית החלבון עצמה9,10. הסטויכוריקה הפפטיד היא גם בעלת נחישות עצמית, ותוספת של שומנים אקסוגני אינם נחוצים. היווצרות peptidisc מתרחשת על ידי דילול כביסה פשוטה, יתרון חשוב מעל דיאליזה או ספיחה על חרוזי פוליסטירן, אשר לעתים קרובות לגרום לתשואה נמוכה בחלבון בשל שיוך משטח לא ספציפי וצבירה11,12 ,13. ההרכבה הסופית של peptidisc הינה מאוד מתוחכמת ומסיסה תמיד במאגרים שונים או בנוכחות של הסדר הדיאונטי (למשל, Ni2 +). הטוהר והאחידות המבבניים של הפיגום גבוה גם כן (למשל, אנטוקסין-נטול), והפפטיד ניתן להתאמה אישית עם קבוצות פונקציונליות ממוקמות בתנוחות שונות.
אנו מציגים כאן זרימת עבודה מעבדה בשם PeptiQuick, הידוע גם בשם מחדש חרוזים החוקה9. פרוטוקול זה משלב טיהור חלבון ממברנה והחוקה peptidisc לשלב אחד על התמיכה כרומטוגרפית זהה. כפי שהשם מציין, PeptiQuick הוא מהיר לעומת שיטות אחרות לחוקה מחדש, וזה גם מפחית ברצינות את זמן החשיפה לניקוי. אפקטים של חומרי ניקוי שליליים כגון התפתחות החלבון והצבירה מתרחשים לעתים קרובות באופן תלוי-זמן; לכן, הפחתת חשיפה לחומרי ניקוי היא קריטית לשמירה על היווצרות חלבון מקורי14,15. הדבר חיוני לדיוק של שיטות שדווחו על אינטראקציות חלבונים וליגוניות כריכה.
תוך כדי פיתוח פרוטוקול זה, אנו מציגים את הגרסה הביוטילתיתיאותשל הרומן של הפיגום פטישיו, הנקרא ביו-פטיפדיסק. קבוצות פונקציונלית ביוטין לאפשר החזקה של חלבון ממברנה היעד על משטחים מצופים streptavidin. מאז תיוג ביוטין מוגבל הפיגום, אתרי קשירה על חלבון ממברנה היעד נשארים ללא שמות. באמצעות ביו-Peptidisc, קינטיקה מחייבת של קולטן קרום בקטריאלי FhuA ו מיקרוביאלית פפטיד מדיום (קולם) נקבעים16. אהדה זו נמדדת על-ידי ביטוייר אינטרמוטמטריה (בלי), המנתח אינטראקציות בזמן אמת על בסיס דפוסי הפרעות אור לבן המשתקף מעצת חיישן.
על-ידי שימוש בפרוטוקול זה, הצורך בניקוי במהלך ניתוח בלי הפרעה מסולק, שהוא התפתחות חשובה, כמו שחומרי ניקוי יכולים לשבש את האינטראקציות. כריכת קשרים ניתן למדוד במהירות עם שיטה זו, ואת התוצאות הן דומות לאלה שדווחו מוקדם יותר באמצעות nanodiscs ו איזותרמי טיטור calorimetry (התיכון)16. השלבים הקריטיים בזרימת העבודה PeptiQuick מוצגים ודנים, כגון הכנה לחלבונים, דילול חומרי ניקוי, תוספת פפטיד ושיטת החוקה, יחד עם עצות לפתרון בעיות של ליגו ו-אנליטה כריכה בתוך המסגרת. באמצעות זרימת העבודה PeptiQuick, מתגלה כי חלבונים ממברנה ניתן ללכוד ב peptiquick והאינטראקציות שלהם נמדד בתוך יום.
בעוד דטרגנטים להישאר את השיטה הפשוטה ביותר כדי לחלץ ולטהר חלבונים ממברנה, אלה הגולש יכול להיות השפעות לא רצויות רבות על יציבות החלבון, פונקציה, וניתוחים במורד1,2,3, 4,5,6,7,8,9. קשיים אלה התקשו על התפתחות מימטיקה קרום, אשר שואפים למזער את הנוכחות של דטרגנטים ולשכפל את הסביבה ממברנה יליד ככל האפשר2,3,4 ,5,6. הרוב של שיטות החוקה, לעומת זאת, דורשים אופטימיזציה משמעותית של תנאי החוקה ולעתים קרובות דורשים שלבי טיהור נוספים, אשר מפחיתים את התשואה הסופית7,8. Peptidisc באופן ספונטני מסתגל לחלבון ממברנה היעד יחסית, דורש אופטימיזציה קטנה וטיהור במורד הזרם9,10. בפרוטוקול זה, PeptiQuick מוצג כאמצעי פשוט כדי לייעל את פרוטוקול החוקה של במורד הזרם חלבון-חלבון ניתוח.
למרות שברור, ישנן מספר אזהרות נסיוניות שיכולות להוביל לכינון מחדש לא מוצלח. בין אלה, הנפוץ ביותר הוא בשל צבירת חלבון. לפיכך, קריטי לבצע את הגודל כרומטוגרפיה כדי לפקח על תהליך החוקה החוזרת. לדוגמה, שיא החרגת מהגודל בנפח הריק מעיד על אגרגטים בחלבון (איור 3b)17,18. אגרגטים ממברנות חלבון בדרך כלל ליצור על חשיפה ממושכת לתנאי ניקוי תת-אופטימלי לפני החוקה מחדש. בפרט, זה נמצא כי חלבונים הממברנה בדטרגנטים נוטים ליצור אגרגטים כאשר מרוכזים על ידי אולטראפילטרציה על מכשירים צנטריפוגליים. במקרה זה, חלבונים קרום רגיש עשוי להיות מרוכז באמצעות ואקום אולטרה סינון, שיטה עדינה יותר הומוגנית של ריכוז מאז ספיחה של חלבונים למסנן הוא פחתה.
באופן כללי, כדי למנוע ריכוז חלבונים, שברים IMAC מתחמק צריך להיות ממאגר, ו סדרת מחלקים מוזרק על עמודה הדרה גודל כדי לבדוק את איכות החוקה החוזרת שלה. יש לציין כי ללא שולבו משחרלי פפטיד בחינם רק לאחר שיא peptidisc הראשי (איור 3B). הגרדום החופשי לא בהכרח. מעכב ניסויים במורד הזרם עם זאת, אם יש צורך, עודף זה יכול להיות מוסר על ידי כרומטוגרפיה הדרה בגודל. לחילופין, הגדלת נפח לשטוף במהלך החוקה, ולפני הימנעות שרף IMAC, מספיק כדי להסיר ביעילות את רוב פפטיד peptidisc בחינם. לכן, כרומטוגרפיה של החרגת מהגודל מומלצת כאמצעי מהיר ופשוט לבדיקת איכות החוקה החוזרת.
הניסוי בלי מחייב אופטימיזציה קפדנית של ריכוזי ליגו ואנליטה. הכריכה צריכה להספיק כדי לקבל אות ברור, אך העמסת יתר תגרום לרוויית אות, מה שמביא לנתוני נתונים מצפיפות יתר ומעיכוב הפרעה במשטח הקצה. לפיכך, הן ריכוז הליזמן ואורך החיים שבהם התשר מעביר את התמיסה והפתרון חייב להיות מיטבי עבור כל דגימת חלבון (איור משלים 2). ריכוז האנליטה חייב גם להיות מיטבי. אם קבוע הדיסוציאציה ידוע, צעד זה הופך לקל יותר, מכיוון שניתן לשלב את טווח הריכוז. נקודת התחלה טובה לניתוח זה משתמשת בריכוזים של חלבון בין 0.1-ו-20-לקפל את המצופה Kd19.
בעקבות רכישת נתונים בלי לעשות זאת, יש לבצע ניתוח נתונים קפדני כדי להימנע מפענוח שגוי. החישוב של קבוע הדיסוציאציה תלוי בהתאמה של עקומה מחייבת. אלא אם כן הסטואיצ’ימטריה כבר ידוע, מודל האינטראקציה הקלאסית 1:1 biמולקולריים יש להשתמש עבור המדידה הראשונית. יש לציין כי עקומת קשירה הטרוגנית היא לעתים קרובות תוצאה של חפצי אמנות והתנהגות לא אידיאלית הנגרמת על ידי ריכוז אנליטה גבוהה, אשר יכול להיות מפורש כמודל כריכה מורכבת. לכן, הפחתת הריכוז האנליטה עד שהפרופיל הססורגרם מציג 1:1 כריכת הסטויכמטריה יכולה לעזור להבדיל בין הכריכה הטרוגנית לבין אינטראקציות מורכבות יותר. כל שרידי נתוני קשירה הטרוגנית מוזלים לאחר מכן כמוצג באיור 420.
בדוח זה, קבוע הדיסוציאציה של 2.28 ± 0.74 nM עבור האינטראקציה של FhuA-קולם נמדדת. ערך זה מתאים לקבוע הדיסוציאציה שנקבע בעבר בקבוצה שלנו עם ננו-דיסק או peptidisc באמצעות החברה האלקטרונית או MST, בהתאמה (איור 4E)16. עקביות זו מספקת ביטחון על החוקה peptidisc וניתוח בלי לעשות כאמצעי כדי לקבוע את הקינטיקה אינטראקציה. חשוב מכך, יש לציין כי חלבונים הם בדרך כלל מקיבוע על streptavidin אנלייזרים או באמצעות ביוטין החוצה קישור כימי או תוספת ספציפית לאתר באמצעות E. coli ביוטין ליגאז בירה21. במקום חלבון הממברנה המיועד. יש יתרונות רבים ביוטילציה הגרדום חוסך זמן וממזער את הפוטנציאל לשבש אתרי כריכת חלבונים חשובים. גילינו גם כי PeptiQuick הוא ישים מגוון רחב של שיעורי היעד חלבון, כולל G-חלבון מצמידים קולטנים (GPCRs), ערוצי יון, ו β-חביות חלבונים ממברנה. באופן כללי, יש לציין כי תמצית חומרי הניקוי הראשונית של חלבונים ממברנות למצב ללא צבירה היא קריטית, והחוקה המיידית של peptidisc מקטינה את בעיות צבירת הזרם. לאור הפשטות, זה נראה כי PeptiQuick יהיה מורחב streptavidin אחרים מבוססי איגוד מבוסס, כגון משטח תהודה המשטח (SPR), אליסה assays, ואהדה משיכה מורדות באמצעות חרוזים streptavidin.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים על מדעי הטבע והמועצה לחקר ההנדסה של קנדה. JS מכיל מלגת CGS-M CIHR. זה היה נתמך על ידי המחקר ביוטכנולוגיה ומדעי ביולוגי המועצה במימון הכשרה לדוקטורט בדרום מערב Biosciences הדרכה [הכשרת הפניה BB/M009122/1]. FD הוא יו ר מחקר ברמה II של קנדה.
30 kDa cut-off centrifugal concentrator | Millipore Sigma | C7715 | – |
Ampicillin | BioShop | 69-52-3 | Sodium Salt |
Bio-Peptidisc Peptide | Peptidisc Biotech | https://peptidisc.com | – |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | Lyophilized powder |
CaCl2 | Fisher Chemical | 10035-04-8 | Certified ACS |
EDTA | BioShop | 6381-92-6 | Biotechnology Grade |
Ettan LC (AKTA) | Amersham Pharmacia Biotech | 18-1145-58 | – |
Glucose | BioShop | 50-99-7 | Anhydrous, Reagent Grade |
Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | Certified ACS |
Imidazole | BioShop | 288-32-4 | Biotechnology Grade |
Lauryldimethylamine oxide (LDAO) | Sigma | 101822204 | ~30% in H2O |
MgSO4 | Fisher Chemical | 10034-99-8 | Certified ACS |
Microfluidizer | Microfluidics | M-110L | Fit with F20Y 75µ diruption chamber |
Ni-NTA Resin | Gold Biotechnology | H-320-50 | – |
Non-binding 96well BLI Plate | Greiner Bio-one | 655076 | Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding |
Octet Red96 | FortéBio | OCTET RED96E-GxP | Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma | P-7626 | – |
Protein Assay Dye – Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Used in the bradford assay to determine protein concentration – 5x concentration |
Sodium Chloride (NaCl) | BioShop | 7647-14-5 | Biotechnology Grade |
Streptavidin (SA) Biosensors | ForteBio | 18-5019 | One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications. |
Superdex S200 (300/10) | Amersham Pharmacia Biotech | 175175-01 | – |
Thiamine | Merck | 69271 | – |
Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | Reagent Grade |
Triton X-100 | BioShop | 900998-1 | Biotechnology Grade |
Tween-20 | BioShop | 56-40-6 | Reagent Grade |
Ultra centrifuge | Beckman Coulter | 365668 | – |