Efficiënt transcriptionally Gecontroleerd Plasmid Expression System voor onderzoek van de stabiliteit van mRNA Transcripts in primaire Alveolar EpitheelCellen

Er zijn verschillende technieken ontwikkeld om de halflevensduur van mRNAs te bepalen. De pulse-chase verval techniek, die gebruik maakt van gelabelde mRNAs, zorgt voor de gelijktijdige evaluatie van een grote pool van mRNAs met minimale cellulaire verstoring. Deze benadering staat echter geen directe schatting toe van de halfringstijd van één enkel gentranscript en kan niet worden uitgevoerd om de posttranscriptional modulatie van een mRNA te bestuderen na stimulatie met groeifactoren, ROS, alarminen of^ontsteking1.

Het gebruik van transcriptieremmers, zoals actinomycine D en α-amanitine, is een relatief eenvoudige methode voor het meten van mRNA afbraakkinetiek in de tijd. Een belangrijk voordeel van deze aanpak ten opzichte van die van eerdere technieken(d.w.z. pulse-chase) is afhankelijk van de mogelijkheid om de halfduur van een bepaald transcript direct in te schatten en te vergelijken hoe verschillende behandelingen de afbraakkinetiek kunnen beïnvloeden. De aanzienlijke schadelijke impact van transcriptieremmers op de celfysiologie vormt echter een groot nadeel van de aanpak². Inderdaad, de remming van de hele cel transcriptome met deze geneesmiddelen heeft de negatieve bijwerking van verstoren de synthese van belangrijke elementen die betrokken zijn bij mRNA stabiliteit, zoals microRNAs (miRNAs), evenals de expressie en synthese van RNA-bindende eiwitten, die belangrijk zijn voor mRNA afbraak en stabiliteit. De ernstige verstoring van gentranscriptie door deze geneesmiddelen zou daarom de degradatiekrommen van transcripties artefactually kunnen wijzigen.

Het promotorinductiesysteem vertegenwoordigt een derde benadering om de halfduur van een specifiek mRNA te meten. Deze methode meet de afbraak van een specifiek mRNA op een vergelijkbare manier als methoden die transcriptieremmers gebruiken. Er worden vaak twee soorten inductiesystemen gebruikt: de door serum geïnduceerde c-fos promotor³ en het Tet-Off onducible systeem⁴. Met het c-fos-systeem is het gebruik van transcriptieremmers die giftig kunnen zijn voor de cel niet nodig. Deze methode vereist echter synchronisatie van de celcyclus, waardoor de evaluatie van de werkelijke stabiliteit van een transcript tijdens interfase⁵wordt voorkomen. Het Tet-Off-systeem maakt daarentegen de sterke expressie van het gen of interest (GoI) mogelijk onder controle van een synthetische tetracycline-gereguleerde promotor. Dit systeem vereist de aanwezigheid van twee elementen die moeten worden gecotransfected in de cel functioneel te zijn. De eerste plasmid (pTet-Off) drukt het regelgevende eiwit tTA-Adv uit, een hybride synthetische transcriptiefactor bestaande uit de prokaryotische repressor TetR (van Escherichia coli) versmolten tot drie transcriptietransactivatiedomeinen van het virale eiwit HSV VP16. De Ingoi wordt gekloond in de pTRE-Tight plasmid onder controle van een synthetische promotor (P_Tight),bestaande uit de minimale volgorde van het cytomegalovirus (CMV) promotor gesmolten tot zeven herhalingen van de tetO operator sequentie. De transcriptie van het gen stroomafwaarts van P_Tight is afhankelijk van de interactie van TetR met tetO. In aanwezigheid van tetracycline of zijn afgeleide, doxycycline, verliest de TetR-onderdrukker zijn affiniteit met de tetO-operator, wat leidt tot een stopzetting van de transcriptie⁴. De kenmerken van het Tet-Off-systeem maken het een ideaal model voor de studie van specifieke mRNA-expressie in eukaryotische cellen, terwijl potentiële pleiotropische effecten worden vermeden die ondergeschikt zijn aan de afwezigheid van prokaryotische regulerende sequenties in eukaryotische cel⁶. Meestal worden dubbel stabiele Tet-Off-cellijnen (HEK 293, HeLa en PC12) met dit systeem gebruikt om kopieën van de regulator en responsplasmids te integreren voor gemakkelijke toegang tot controleerbare genexpressie^7,8,9.

Verschillende modellen van alveolar epitheelcellen in de cultuur zijn gebruikt om de cellulaire en moleculaire biologie van het alveolar epitheel te bestuderen. Jarenlang hebben onderzoekers op grote schaal gebruik gemaakt van menselijke of knaagdier primaire cellen^10,11 evenals vereeuwigde cellijnen zoals de menselijke A549 of rat RLE-6TN cellen^12,13. Hoewel ze over het algemeen minder proliferative en moeilijker te kweken en transfect, alveolar epitheel cellen in de primaire cultuur blijven de gouden standaard voor de studie van de functie en disfunctie van de alveolar epitheel in fysiologische en pathologische omstandigheden. Inderdaad, vereeuwigde cellijnen zoals A549 cellen vertonen niet de complexe kenmerken en fenotypen van primaire cellen, terwijl alveolar epitheliale cellen in de primaire cultuur de belangrijkste eigenschappen van het alveolaire epitheel samenvatten, met name het vermogen om een gepolariseerde en strakke barrière te vormen^14,15. Helaas zijn deze cellen zeer resistent tegen conventionele transfection technieken, zoals die gebruik te maken van liposomen, waardoor het gebruik van een promotor-geïnduceerde systeem zoals Tet-Off zeer moeilijk.

De posttranscriptional modulatie van mRNAs is een van de meest effectieve methoden voor het snel moduleren van de genexpressie van een transcript¹⁶. De onvertaalde regio mRNA 3 (3′ UTR) speelt een belangrijke rol in dit mechanisme. Het is aangetoond dat, in tegenstelling tot de 5′ UTR, er een exponentiële correlatie is tussen de lengte van de 3′ UTR en de cellulaire en morfologische complexiteitvan een organisme. Deze correlatie suggereert dat de 3′ UTR, net als de mRNA-coderingsgebieden, is onderworpen aan natuurlijke selectie om in evolutie¹⁷steeds complexere posttranscriptiemogelijk te maken. De 3′ UTR bevat verschillende bindende sites voor eiwitten en miRNAs die de stabiliteit en vertaling van het transcript beïnvloeden.

In het huidige werk ontwikkelden we een tool om de rol van sterk bewaarde domeinen in de 3′ UTR van een InI voor de controle van de stabiliteit van het transcript te onderzoeken. We richtten ons op het epitheliale natriumkanaal, alfa subunit (αENaC), die een belangrijke rol speelt in alveolar epitheelfysiologie¹⁸. Alveolar epitheelcellen in de primaire cultuur werden met succes tijdelijk transfected met de twee componenten van het Tet-Off-systeem, dat het mogelijk maakt voor de studie van de rol van de 3′ UTR in mRNA stabiliteit met een systeem dat minimaal van invloed op de celfysiologie en metabolisme in vergelijking met het gebruik van transcriptieremmers met andere protocollen. Een kloonstrategie werd ontwikkeld om de expressie van de Ini te onderscheiden van die van het endogene gen met behulp van een nonendogene uitgedrukte epitope (V5). De respons en regelgevende plasmiden werden vervolgens overgebracht naar alveolar epitheel cellen met behulp van een pipet elektroporatie techniek. Vervolgens werd de expressie van het transcript gemeten door de cellen met doxycycline op verschillende tijdstippen uit te broeden. De halfwaardetijd van het transcript werd geëvalueerd door RT-qPCR met een aangepaste Cq-methode met behulp van het transfected tTA-Ad mRNA product voor normalisatie. Door middel van ons protocol bieden we een handige manier om de posttranscriptional modulatie van een transcript onder verschillende voorwaarden te bestuderen en de betrokkenheid van de onvertaalde regio’s in meer detail te definiëren.