NF-κB-תלוי לוציפראז הפעלה וקוונפיקציה של ביטוי גנים ב סלמונלה הרקמה הנגועה התרבות תאים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול במהירות ובקלות למדוד גורם גרעיני קפא-אור-שרשרת-משפר של תאים B מופעל (NF-κB) הפעלה קווי התא המבטא NF-κB:: לוציפראאז בונה הכתב, דרך מדידות של לומינציה בתא ליפוסט. בנוסף, ביטוי הגנים נקבע באמצעות RT-qPCR מבודדים מתאים נגועים סלמונלה typhimurium.
Abstract
Dimeric שעתוק מקדם NF-κB מסדיר מסלולים רבים תגובה תאית, כולל מסלולים דלקתיים על ידי גרימת ביטוי של ציטוקינים שונים ונוגדנים. NF-κB הוא ביטא מבחינה חוקתית והוא מוקף בציטוזול על ידי הגורם הגרעיני של חלבון המעכב של קאפה אור פוליפטידים גנים משפר ב-B מעכב תאים, אלפא (IκBα). ההפעלה של NF-κB דורש השפלה של IκBα, אשר חושף אות לוקליזציה גרעינית על NF-κB ומקדם את הסחר שלה לגרעין. פעם אחת בגרעין, NF-κB נקשר לאזור מקדם של κB מטרה גנים כגון אינטרלויקין 6 (il-6) ו-IL-23, כדי לקדם את הביטוי שלהם.
ההפעלה של NF-κB מתרחשת באופן עצמאי של תמלול או תרגום. לכן, מצב ההפעלה של NF-κB חייב להיות נמדד על ידי כימות NF-κB במיוחד בגרעין, או על ידי כימות הביטוי של הגנים היעד NF-κB. בפרוטוקול זה, תאים באופן מאוד מנוכר עם NF-κB:: בניית הכתב לוציפראז הם המאייד עבור הפעלה NF-κB באמצעות טכניקות התרבות של רקמת מבחנה. תאים אלה נגועים בסלמונלה typhimurium כדי להפעיל את NF-κB, אשר טרפיics לגרעין ונקשר לאתרי κB באזור המקדם של לluciferase, גרימת הביטוי שלה. התאים מנותחים ומנותח עם. מערכת השיטת הליפראז כמות לוציפראז המיוצר על ידי התאים באמצעות העוצמה של אות האור, אשר מזוהה על ידי קורא צלחת. האות שנוצר על ידי הליך זה מספק שיטה מהירה ורגישה מאוד להערכת הפעלה NF-κB תחת מגוון של תנאים. פרוטוקול זה מנצל גם שעתוק כמותי הפוכה PCR (RT-qPCR) כדי לזהות רמת mRNA היחסי המעידים על ביטוי גנים.
Introduction
משפחת הגרעין κB (NF-κB) של חלבונים הם שעתוק חשוב המווסת את הביטוי הגנטי במסלולים ביולוגיים שונים. הפעלה של NF-κB גורם שעתוק של גנים היעד, רבים מהם חשובים לתגובות החיסונית דלקתית, התפשטות התא, התגובות לחץ התקדמות הסרטן1,2. NF-κB משחק תפקיד בלתי נפרד בתוצאות דלקתיות מוקדם עבור סיווג הפתוגן. בהינתן תהליכים ביולוגיים רבים מתווכת על ידי הפעלה NF-κB, שיבושים איתות יכול להיות השלכות חמורות על בריאות ומחלות. הפסד של פונקציה מוטציות ב-NF-κB איתות משויכים מספר פנוטיפים החיסונית מחסור, בעוד הרווח של מוטציות פונקציה משויכים עם מספר סוגים של סרטן, כולל B-cell לימפומה השד סרטן3. בנוסף, פתוגנים רבים הוכחו ישירות לווסת את מצב ההפעלה של NF-κB באמצעות ביטוי של גורמים התקפה אלימה4,5,6,7.
ההפעלה של NF-κB ידוע להיות תוצאה של גירויים משתנים רבים כולל מוצרים חיידקיים כגון ליפופוליסכולידים (LPS), הפלאג ו peptidoglycans המכונה דפוסי הפתוגן הקשורים מולקולרי (PAMPs). PAMPs אלה מזוהים על ידי קולטני זיהוי תבנית (PRRs) כגון קולטני חיוג כמו (TLRs) ו הנהון כמו קולטנים (NLRs) המוביל ההפעלה של NF-κB ואת הביטוי הבא של מערך של NF-κB-התלויים גנים דלקתיים8. בנוסף הפעלת PRR ידי PAMPs, מוצרים בקטריאליים אחרים, כגון חלבונים אפקטור חיידקי, יכול לגרום להפעלה של NF-κB. מעניין, חיידקים גם לבטא חלבונים אפקטור כי פעיל מחליש את המסלול NF-κB ולשפר את הפתוגניות שלהם, הבקיע את החשיבות של NF-κB כמגשר חיוני של חסינות9.
ישנן חמש יחידות משנה שונות היוצרות את ה-NF-κB דימרס; p50, p52, לה (p65), RelB ו-cRel. שני הטרודינים העיקריים של NF-κB הם p50: לה והp52: הדימרס. הפעיל NF-κB דימרים לאגד אתרי DNA, המכונה אתרי κB, במקדם ומשפר אזורים של היעד גנים שונים. תחת תנאים נורמליים הומסטטיים, NF-κB אינטראקציה עם משפחה של חלבונים מעכבי המכונה IκB חלבונים להישאר פעילים. עם הגירוי, IκB מIκB קינאז (IKK), אשר מאפשר לו להיות ממוקד עבור אוביקווינציה, ולאחר מכן השפלה. השפלה של IκB מפעילה NF-κB על ידי חשיפת אות לוקליזציה גרעינית. NF-κB אז העברה לגרעין, שם הוא מאגד אתרי κB באזור המקדם של גנים היעד ולקדם שעתוק10. כך, הפעלה של nf-κB upregulates mrna ביטוי של גנים היעד nf-κB, ושינוי זה ניתן למדוד באמצעות כימות RNA בחני כגון RT-qpcr11.
מספר שיטות קיימות ומשמשות בדרך כלל עבור המדידה של הפעלה NF-κB, כולל משמרת חשמלית אלקטרופיניטית לנוע (emsa), טרנסלוקציה גרעינית, ו כתבת גנים בחני. EMSA משמש כדי לזהות מכלולי חלבון עם חומצות גרעין. תאים ממריצים הם מאבקים כדי לבודד חלבונים גרעיניים, כולל ממוקם NF-κB, אשר לאחר מכן מודדת עם הנוקלאוטידים מקרינה המכילה את התחום איגוד NF-κB. הדגימות מופעל על ג’ל והוא בתמונה על-ידי האדיגרפיה האוטומטית של חומצה הגרעין 32P שכותרתו. אם NF-κB נמצא בשבר החלבון, זה יהיה לאגד את נוקלאוטידים, אשר יועברו לאט דרך הג ולהציג כמו להקות דיסקרטית. שברים גרעיניים של תאים חסר NF-κB (למשל, בתאי בקרה בלתי מגורה) יפיק לא להקות כמו נוקלאוטידים להגר מהר יותר לסוף ג’ל. החיסרון העיקרי של שיטה זו היא כי היא כמותית במידה רבה במובן הבינארי (כלומר, on או off) ואינו מספיק ללכוד הבדלים משמעותיים בקיבולת האיגוד NF-κB. בנוסף, שיטה זו אינה מחשיבה מבנים כרומטין החשובים מבחינה פונקציונלית עבור גנים היעד של NF-κB12,13.
בדומה לשיטה הקודמת, קיים שיטת “ללא משמרת”, שבה לוחות מרובים מצופים בנוקלאוטידים המכילים את רצף הכריכה NF-κB. לאחר טיפול בתאים עם שברים גרעיניים של חלבון, NF-κB יהיה לאגד את הנוקלאוטידים כרוך לבאר. נוגדנים Anti-NF-κB לאחר מכן, אשר יהיה אינטראקציה עם מאוגד NF-κB ולייצר אות מטרי צביעה ביחס לסכום של NF-κB, המציין את מידת ההפעלה NF-κB. שיטה זו היא יתרון על EMSA כי הוא אינו דורש חומצות גרעין רדיויניום והוא כמותי, בהשוואה. עם זאת, אזהרה של שיטה זו היא כי שוב אינו מבדיל בין מדינות כרומטין של היעד NF-κB גנים14.
שיטה נוספת שבאמצעותה ההפעלה NF-κB ניתן לזהות היא על-ידי כרומטין immunoprecipitation (שבב), לפיו ה-DNA ו חלבונים אינטראקציה הם מקושרות עם פורמלדהיד ו immunoprecipitated עם נוגדנים אנטי NF-κB ספציפי. שברי הנוקלאוטידים הספציפיים מטוהרים ומזוהים באמצעות הגברה של PCR או רצף התפוקה הגבוה הישיר. תוצאות שנוצרו משיטה זו מספקות תוצאות חצי כמותיים של פעילות איגוד NF-κB עם גנים מכוונים. עם זאת, התוצאות תלויות מאוד בתנאי הקיבוע ובתהליכי הטיהור בכל שלב15.
ב טרנסלוקציה גרעינית, תאים מגורה כדי לגרום NF-κB הפעלה ולאחר מכן תוקן. נוגדנים נגד p65 נוספים לתאים קבועים. לחילופין, p65 יחידת עצמה יכול להיות מתויג עם פפטיד פלורסנט כגון פלורסנט ירוק ירוק (gfp). בכל מקרה, האימונולובורנציה יאפשרו הדמיה של הלוקליזציה של p65 כדי לקבוע התפלגות תאית. על ידי מדידת הפרופורציה של cytosolic וחלבון גרעיני מקומי, החוקרים יכולים לקבוע את מצב ההפעלה היחסי של NF-κB. חיסרון של שיטה זו היא כי הimmunofluorescence היא יחסית זמן רב, דורש נוגדנים יקרים, והוא זקוק למומחיות טכנית גבוהה יחסית16.
גנים עיתונאי משמשים בדרך כלל כלים לחקר דפוסי הרגולציה והביטוי של גן של עניין. בדרך כלל, גנים העיתונאי נבנים מרצף היזם של גן של עניין התמזגו לקידוד גנים עבור חלבון ניתן לזיהוי בקלות. חלבונים עם פעילויות אנזימטיות, מאפיינים של קרינה פלואורסצנטית, או מאפייני האור, נבחרים בדרך כלל ליכולתם להיות מרותחת וכימות. לפיכך, הקריאה-out (למשל, לומינציה, זריחה) משמש כאות לגילוי הביטוי הגן. בנייה אלה עיתונאי ניתן להציג לאחר מכן סוגי תאים שונים, כגון תאים אפיתל או מקרופאגים.
המתואר בפרוטוקול הוא השימוש קו משוכפל תא החלה (הלה 57 א) כי הוא העביר באופן מספק עם כתב לוציפראז המכיל שלושה עותקים של הקונצנזוס κB של הκ החיסוני של מקדם השרשרת של השיווק באזור17. הביטוי של לוציפראז תלוי בהפעלה של NF-κB, אשר מתרחשת בעקבות גירוי התא. תאים ממריצים הם בקלות לאחר באמצעות מאגר לפירוק תאים המסופקים בערכת שיטת לוציפראז. חלק של התא ליפוסט מעורבב אז עם מאגר שיטת ללוציפראז המכיל ללוציפראז. לluciferin היא מצע של לוציפראז והוא נדרש עבור דור האור בנוכחות של לוציפראז. לאחר שילוב מאגר העיבוד עם הליפוסט, הפתרון פולט אור בתהליך הידוע בשם הומינסנציה. כמות האור המיוצר, שניתנה ב לומן, הוא פרופורציונלי כמות לוציפראז נוכח בבית הליפוסט ומשמש כמדד של הפעלה NF-κB. קריאות לומן מפורשים בהשוואה לתקן בלתי מגורה לחשבון עבור פעילות בסיסית NF-κB והאות עצמו יציב למשך מספר דקות כדי לאפשר מדידה אמינה. בנוסף, ה-“הלה 57” קו התאים מנוכר באופן מאוד עם כתבת β-κB. הכתבת הβ-גלטוסידאז מתבטאת באופן מכונן, והפעילות הβ-גלטוסידאז יכולה להיות נמדדת לשליטה על הכדאיות התאית או הווריאציה במספר התאים17. הערכים לוציפראז יכולים להיות מותאמים לערכים β-גלטוסידאז ודיווחו על הגדלת הקיפול על תאי הבקרה הבלתי ממריצים.
מאז NF-κB הוא הגורם שעתוק אחראי על הביטוי המוגבר של גנים היעד התלויים NF-κB, ניסוי מעקב כדי לשלוט על NF-κB תלויי תלוי ביטוי הגנים הוא שעתוק הפוכה כמותית התגובה שרשרת פולימראז ( RT-qPCR). RT-qPCR היא שיטה רגישה מאוד, שבאמצעותה ניתן לכמת את השינויים בביטוי הגנים במספר הזמנות של סדר גודל. תאים ממריצים ובקרה נקצרו עבור RNA באמצעות כלורופורם פנול-הכלורופורם. לאחר הפרדת הפאזה, ה-RNA מופק כמרכיב העיקרי של השכבה הימית. RNA הוא אז זירז ונשטף כדי לייצר גלולה טהורה. גלולה זו היא לאחר מכן מחדש וניקה נוספת של דנ א מזוהם באמצעות טיפול DNase. ה-RNA הטהור הפוך לאחר מכן ליצירת דנ א משלים (cDNA). CDNA זה יכול להיות מנותח באמצעות טכניקות PCR כמותיים, שבו שפע של רצף mRNA ספציפי הוא כימות כדי לקבוע ביטוי גנים. טכניקה זו אינה מחשיבה את השליטה בשיטת התרגום, שינוי העברה באמצעות שינויים, שפע החלבון או פעילות החלבונים. עם זאת, גנים רבים, במיוחד אלה המעורבים בתהליכים הפרו-דלקתיים, מוסדרים דרך NF-κB ו-mRNA שלהם מעיד על הביטוי שלהם.
השיטה המוצעת כאן משתמשת בדרך מהירה ופשוטה, שבאמצעותה ההפעלה NF-κB ניתן לזהות באמצעות האור הדרך של ליפוסט הסלולר. RT-qPCR של הביטוי הגנטי NF-κB היעד יכול לשמש לכמת ביטוי של גנים מסוימים, כמו גם לאמת פעילות פונקציונלית של הפעלה NF-κB. היתרונות העיקריים של מערכת כזו הם הפשטות והמהירות שלה, אשר מאפשר הקרנת תפוקה גבוהה של מגוון של מצבים לווסת הפעלה NF-κB. פרוטוקול זה מתאים קווי תאים אחרים המבטא NF-κB:: הכתב לluciferase, ו הפגינו באופן בלתי נשכח 264.7 תאים גולמיים RAW18. כמות הזמן הנדרשת לטיפול בדגימות, החל מפירוק התא ליצירת אות הארה, היא מינימלית ואורכת כשעה. מדידת NF-κB דורש רק ציוד מעבדה בסיסי כגון לוחות אטומים, קורא צלחת המסוגל למדוד הזדקנות, ותוכנות ניתוח נתונים פשוטים כגון תוכנית גיליון אלקטרוני.
Protocol
Representative Results
Discussion
התרומה העיקרית של הפרוטוקול המתואר היא כי היא מספקת שיטה מהירה וקלה לזהות הפעלה NF-κB בתאים, אשר מאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של מצבים גירוי מרובים או תרופות המשפיעים על הפעלת NF-κB. כאן, אנו מתארים פרוטוקול עבור הפעלה NF-κB בתאי הלה נגועים בסלמונלה. תאים אלה יכולים לשמש זיהום עם פתוגנים אחרים, כ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר במעבדת קאסטרה-Gounder נתמך על ידי מענקים מתוך הניסיוע של NIH תחת מספר הפרס R21AI122092 ומתוך האגודה האמריקנית לסוכרת תחת מספר הפרס 1-18-JDF-035.
Materials
| Adhesive film | VWR International | 60941-070 | |
| chloroform | Fisher Bioreagents | C298-500 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11665092 | |
| DNAse treatment kit | Qiagen | 79254 | |
| dNTPs | Promega | U1511 | |
| ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818100 | molecular grade |
| FBS | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| HeLa 57A cells | Ref # 15 | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| isopropanol | Fisher Bioreagents | BP26181 | |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | BP906-5 | |
| LB agar | Fisher Bioreagents | BP1425-500 | |
| Lysogeny broth | Fisher Bioreagents | BP1426-500 | |
| MgCl2 | Fisher Chemical | ||
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Scientific | spectrophotometer | |
| promega luciferase assay system | Promega | E1501 | Cell lysis buffer & luciferin substrate |
| Random Hexamers | Thermo Scientific | SO142 | |
| Real-time GAPDH forward primer | 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3' |
||
| Real-time GAPDH reverse primer | 5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3' |
||
| Real-time IL-23 forward primer | 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3' |
||
| Real-time IL-23 reverse primer | 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3' | ||
| Real-time IL-6 forward primer | 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3' | ||
| Real-time IL-6 reverse primer | 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3' |
||
| Reverse Transcriptase | Applied Biosystems | 4308228 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| RT buffer | Promega | A3561 | |
| SL1344 | Ref # 17 | ||
| SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SYBR green | Applied Biosystems | 4309155 | 2x mastermix |
| Tri-reagent | Molecular Research Center | TR 118 | guanidine thiocyanate |
| Trypsin -EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| ultrapure water | Fisher Bioreagents | BP248450 | |
| Well plate for PCR | VWR International | 89218-294 | 384-well plate |
References
- Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. NF-kappaB signaling in inflammation. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).
- Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (3-4), 478-486 (2006).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), a001651 (2009).
- Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB. Journal of Virology. 80 (21), 10565-10578 (2006).
- Zaragoza, C., et al. Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103 (50), 19051-19056 (2006).
- Gao, X., et al. Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function. PLOS Pathogens. 5 (12), e1000708 (2009).
- Kravchenko, V. V., et al. Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule. Science. 321 (5886), 259-263 (2008).
- Kawai, T., Akira, S. Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends in Molecular Medicine. 13 (11), 460-469 (2007).
- Pinaud, L., Sansonetti, P. J., Phalipon, A. Host Cell Targeting by Enteropathogenic Bacteria T3SS Effectors. Trends in Microbiology. 26 (4), 266-283 (2018).
- Karin, M. How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex. Oncogene. , (1999).
- Berti, R., et al. Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 22 (9), 1068-1079 (2002).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
- Holden, N. S., Tacon, C. E. Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63 (1), 7-14 (2011).
- Renard, P., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Research. 29 (4), E21 (2001).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39 (5), 715-725 (2005).
- Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages. Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).
- Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. T., Dargemont, C. Nuclear retention of IkappaBalpha protects it from signal-induced degradation and inhibits nuclear factor kappaB transcriptional activation. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 9108-9115 (1999).
- Mendez, J. M., Kolora, L. D., Lemon, J. S., Dupree, S. L., Keestra-Gounder, A. M. Activation of the endoplasmic reticulum stress response impacts the NOD1 signaling pathway. Infection and Immunity. , (2019).
- Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. D. Aromatic-Dependent Salmonella-Typhimurium Are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines. Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).
- Keestra, A. M., et al. Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1. Nature. 496 (7444), 233-237 (2013).
- Wong, D., et al. Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits. Genome Biology. 12 (7), R70 (2011).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nature Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
- Cogswell, J. P., et al. NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site. Journal of Immunology. 153 (2), 712-723 (1994).
- Thornberry, N. A., et al. A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
