Vi beskriver en protokol til ultralyd guidet implantation af murine-afledte pancreas duktalt adenocarcinom cellelinjer direkte ind i den indfødte tumor site. Denne fremgangsmåde resulterede i bugspytkirtel tumorer detekterbare ved ultralydsscanning inden for 2-4 ugers injektion, og signifikant reduceret andelen tumor celle såning på peritonealdialyse væggen i forhold til kirurgisk ortotopisk implantation.
Den nylige succes med immun check point blokade i melanom og lunge adenokarcinom har galvaniseret feltet af immuno-onkologi samt afsløret begrænsningerne af de nuværende behandlinger, som de fleste patienter ikke reagerer på immunterapi. Udvikling af nøjagtige prækliniske modeller til hurtigt at identificere nye og effektive terapeutiske kombinationer er afgørende for at løse dette uopfyldte kliniske behov. Pancreas duktalt adenocarcinom (PDA) er et kanonisk eksempel på en immun check point blokade resistente tumor med kun 2% af patienterne reagerer på immunterapi. Den genetisk manipulerede KrasG12D +/-; Trp53R172H +/-; PDX-1 CRE (KPC) musemodel af PDA rekapitulerer menneskelig sygdom og er et værdifuldt redskab til vurdering af terapier for immunterapi resistente i prækliniske omgivelser, men tid til tumor debut er meget variabel. Kirurgisk ortotopisk tumor implantation modeller af PDA opretholde immun biologiske kendetegn af KPC vævs specifik tumor mikromiljø (TME) men kræver en tidskrævende procedure og indføre afvigende inflammation. Her bruger vi en ultralyd-guidet ortotopisk tumor implantation model (ug-Otim) til ikke-invasivt injicere KPC-afledte PDA cellelinjer direkte ind i mus bugspytkirtlen. UG-OTIM tumorer vokse i det endogene væv site, trofast rekapitulere histologiske funktioner i PDA TME, og nå indskrivning størrelse tumorer for prækliniske undersøgelser af fire uger efter injektion med minimal såning på peritonealdialyse væggen. UG-OTIM-systemet beskrevet her er en hurtig og reproducerbar tumor model, der kan give mulighed for høj gennemløbs analyse af nye terapeutiske kombinationer i murine PDA TME.
Pancreas duktalt adenokarcinom (PDA) er en notorisk aggressiv sygdom, der er refraktær over for aktuelle behandlinger, med en dystre 5-årige overlevelse på 9%1. PDA for nylig overgået brystkræft til at blive den tredje førende årsag til kræft-relaterede dødelighed i USA og forventes at blive den anden-førende årsag (bag kun lungekræft) i år 20302. En række funktioner karakteristisk for immunologisk ‘ kold ‘ PDA tumor mikromiljø (TME)-herunder høj infiltration af Immunsuppressive myeloid cellepopulationer3,4,5,6,7, tætte stromale deposition8,9,10,11, og en mangel på T-celler5,12,13-bidrage til svigt af immunoterapi i PDA14. Med henblik herpå er brugen af en klinisk relevant dyremodel et vigtigt redskab til at undersøge effekten af nye lægemiddelkombinationer for immunologisk kolde tumorer in vivo.
Den genetisk manipulerede KrasG12D +/-; Trp53R172H +/-; PDX-1 CRE (KPC) musemodel af PDA overfører trofast de vigtigste kliniske aspekter af human PDA, herunder de molekylære drivkræfter for sygdom og histopatologiske funktioner15. KPC tumorer udvikler sig spontant i fuldt immunkompetente mus, giver mulighed for forhør af terapeutiske tilgange, herunder kemoterapi16,17, immunterapi18,19,20,21, og stroma-målretning terapi9,11,22in vivo før administration af disse lægemidler i den kliniske forsøg indstilling. På trods af sine mange styrker som en præklinisk model af PDA, er brugen af KPC mus dårligt stillet af den meget variable progression af spontan tumor udvikling som tumor debut kan variere fra 4 til 40 uger (hvilket kræver opretholdelse en stor avl koloni)15. Derudover har KPC-mus potentialet for polyklonale primære tumorer23, og der er en hurtig nedgang i dyrs sundhed og stigning i co-morbiditeter, herunder kakeksi og ascites som sygdom skrider15.
Et alternativ til den spontane KPC musemodel er at bruge en ortotopisk implantation model af PDA24. Den direkte kirurgiske implantation af tumorcellelinjer i til den indfødte væv site er en mere omkostningseffektiv og forudsigelig metode til at rekapitulere vævs-specifikke tumor mikromiljø (TME) af PDA. Tumor implantation giver mulighed for injektion af klonale tumorcellelinjer til genetisk backkrydsede mus5, giver mulighed for Host mus med yderligere genetiske manipulationer, der ville være tidskrævende at opdrætte i KPC musemodel. Men, bugspytkirtel tumor implantation kræver en arbejdskraftintensiv kirurgisk procedure, der introducerer afvigende inflammation på sutur stedet i bugvæggen24,25,26, og ofte omfatter en langvarig post-operative opsving27,28,29.
Teknologiske fremskridt inden for ultralydscanning ved hjælp af gnaver specifikke transducere giver billeder i høj opløsning i realtid. Guidet af ultralyd billeddannelse af injektion nål bevægelse i bughulen, kan man specifikt implantat tumorceller i bugspytkirtlen, udnytte fordelene ved ortotopiske tumor injektioner i fravær af kirurgisk implantation og associeret betændelse. Denne tilgang, kaldet ultralyd-guidet ortotopisk tumor implantation model (ug-Otim) er tidligere blevet etableret i en xenograft modeller af kræft i bugspytkirtlen30 samt i flere andre kræft modeller, herunder Ewings sarkom, neuroblastom og blærekræft31,32.
Her, vi giver en detaljeret protokol til udførelse af ultralyd-guidede injektioner af tumorcellelinjer i at murine bugspytkirtlen. Vi viser de resulterende tumorer rekapitulere de histologiske og immunologiske egenskaber af KPC TME og kan derfor anvendes til at undersøge nye terapeutiske kombinationer, herunder immunotherapies, til hurtigt at afsløre de mest lovende behandlinger til at flytte frem til kliniske forsøg.
Vi viser her, at brugen af høj opløsning ultrasonografi til direkte implantation af murine PDA cellelinjer til autoktont væv site er et pålideligt alternativ til både KPC og kirurgiske ortotopisk modelsystemer. UG-OTIM producerer biologisk relevante tumorer, der bevarer de immunopatologiske funktioner i PDA med en forkortet tidsramme til tumor-diagnose og pålidelig tumorvækst kinetik. Ultralyd guidet injektion kan derfor tjene som et nyttigt værktøj til hurtig produktion af mus, der bærer ortotopisk implanteret PDA-tumorer, hvilket giver mulighed for undersøgelse af terapeutiske kombinationer i en klinisk relevant model.
Ultralyd-guidet implantation giver vigtige forbedringer i forhold til standard modeller for præklinisk undersøgelse. For det første eliminerer denne procedure den tidskrævende overvågning af KPC-mus til udvikling af spontane tumorer ved direkte at implantering fuldt ud C57BL/6 backkrydsede PDA-celler i murine bugspytkirtlen. For det andet, svarende til traditionelle kirurgiske ortotopisk injektioner, ug-Otim tilgang giver mulighed for kontrol over celle linjen injiceres, herunder udvælgelse af en monoklonale tumor cellelinje og/eller ex vivo manipulation af celle linjen, samt kontrol over værten modtager tumor celle implantation. For det tredje undgår denne minimalt invasive teknik det besværlige arbejde med overlevelses kirurgi og omgår den komplicerede postoperative restitutionsperiode for dyrene samt inflammatoriske signaler fra kirurgisk sårheling. Endelig, UG-OTIM tumorer-svarende til kirurgisk implantation-rekapitulere TME observeret i KPC mus, herunder lav T celleinfiltration og høj makrofag infiltration. Således, UG-OTIM model bevarer nøglefunktioner i KPC tumorer uden de yderligere komplikationer, der retard terapeutiske undersøgelser i den spontane KPC model.
En række kritiske trin i protokollen er nøglen til at mestre for succesen af teknikken. Ekspertise i murine ultralyd Imaging er afgørende for denne procedure, men den manuelle fingerfærdighed kræves for at kunne implantat celler i bugspytkirtlen er en færdighed sæt, der skal udvikles uafhængigt. For mus på en 12-timers lys/mørk cyklus, fastende dyrene natten sikrede maven og tarmene blev ryddet af enhver uforfordøjet mad, der kunne blokere visning af bugspytkirtlen, nyrer og milt ved ultralyd. Desuden skal hver cellelinje, der anvendes til ortotopisk injektion, titreres før yderligere eksperimenter for at forstå vækst kinetikken og bestemme det metastatiske potentiale33. Under injektionen skabte brugen af pincet til at knibe huden på injektionsstedet den spænding, der var nødvendig for forsigtigt at punktere gennem både huden og peritonealdialyse væggen. Et vigtigt skridt i proceduren var at omhyggeligt guide nålen ind i bugspytkirtlen uden perforering af vævet eller punktering en off-Target site såsom milt eller nyrer. Bekræftelse af en flydende bolt var den bedste indikator for vellykket tumor celle injektion i det rette væv. Efter injektion, nålen skal trækkes langsomt for ikke at forstyrre væsken bolt. Vi konstaterede, at en række prøve injektioner med enten DMEM eller Trypan Blue hjalp med at udvikle en beherskelse af de finmotoriske færdigheder, der var nødvendige for denne injektion.
Under fejlfindingen af denne procedure identificerede vi en række faktorer, der påvirkede protokollens succes. I forsøg eksperimenter, vores hyppigste fejl var perforere nyrerne under implantation, som forekom oftere i vores tidlige eksperimenter tyder på, at regelmæssig udøvelse af denne færdighed forbedrer færdighed. Derudover fandt vi, at bekræfte tilstedeværelsen af en flydende bolt efter tumor celle injektion via både ultralyd og direkte visualisering på nekropsy under fejlfindings fasen forbedret vellykket injektion teknik. Hvis dannelsen af en boble ikke er bekræftet ved ultralyd under injektionen, kan placeringen af nålen justeres før helt deprimerende sprøjten for at frigive den resterende bolt af tumorceller. Vi bemærkede også, at suspension mængder injiceret for hurtigt resulterede i spild af tumorceller i bughulen eller sammenbrud af væsken bolt i bugspytkirtlen. Generelt, disse dyr gik på at udvikle bugspytkirtel tumorer med undtagelse af n = 7 dyr, der viste ingen tegn på tumor 4 uger efter injektion. Dette resultat blev kun rapporteret i vores første forsøg (og 6/7 dyr blev injiceret med en lav titer af tumorceller). Mus, der har tvivlsomme tumor celle injektioner, eller kræver Repositionering af nålen, bør overvåges nøje for udviklingen af tumorer uden for bugspytkirtlen.
De forreste begrænsninger af ultralyd-guidet metode er tilgængeligheden af de nødvendige instrumenter og de tekniske færdigheder i forbindelse med tumor implantation. Proceduren er ikke helt steril, da musen injiceres ikke-sterilely på ultralyd platform, med sprøjten og nål spids passerer gennem ultralyd gel. Selvom vi ikke har set nogen tegn på infektion i n = 148 mus på tværs af i alt 8 uafhængige eksperimenter siden initiering af disse undersøgelser, er det muligt, at en smitsom agens kan trænge ind i bugspytkirtlen gennem kanylen under denne proces. Som sådan bør så mange aspekter af protokollen som muligt (herunder handsker, ultralydflader, iskasser) sprøjtes med desinfektionsmiddel eller 70% ethanol for at reducere den potentielle udsættelse for patogener. En yderligere begrænsning af den nuværende protokol var manglen på metastase ved hjælp af 4662-celle linjen ved de aktuelle fortyndinger. Hver cellelinje, der anvendes i UG-OTIM-systemet, bør titreres til de ønskede vækstrater samt metastatisk potentiel33. Endelig etablerede vores nuværende protokol teknikker til injektion af tumorceller i en enkelt cellesuspension. Men, tilsætning af en ekstracellulær matrix substrat kunne tilsættes til potentielt forbedre tumor etablering og forhindre tumor celle lækage (som det anvendes i kirurgiske implantation modeller27,30,31,32). Således kan mange af begrænsningerne af UG-OTIM overvindes med passende testning af de cellelinjer, der anvendes i ortotopiske injektioner.
Sammenfattende, UG-OTIM model er en præcis metode til vævs-instrueret injektion af tumorceller i at murine bugspytkirtlen. Denne minimalt invasive implantationsteknik gavner både investigator og dyr ved at reducere procedure tiden, minimere post kirurgiske komplikationer og forbedre nøjagtigheden af injektionen. Tumorer som følge af UG-OTIM injektioner bevarer de karakteristiske immun biologiske egenskaber af spontane KPC tumorer, har pålidelig tid til tumor debut, og reproducerbare tumorvækst kinetik. Derfor kan UG-OTIM-modellen anvendes i en relativt høj gennemløb til at afhøre terapeutiske kombinationer i prækliniske omgivelser for at afsløre nye behandlinger for patienter med det største uopfyldte kliniske behov.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker at takke Dr. Robert Vonderheide og alle medlemmer af Vonderheide laboratorium, alle medlemmer af pancreas cancer Mouse Hospital, Dr. ben Stanger, bugspytkirtlen Cancer Research Center ved University of Pennsylvania, og Devora Delman for nyttige diskussioner. Dette arbejde er understøttet af finansiering fra Parker Institute for cancer immunterapi stipendiat (KTB) og bugspytkirtlen Cancer Research Center på University of Pennsylvania (CC).
50 mL Conicals | Thomas Scientific | 2602A26 | |
Blunt edged forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Cell Dissociation Buffer | Thermo-Fisher | 13151014 | |
Cotton Tipped swabs | Thermo-Fisher | 19062614 | |
Covidien Monoject 3/10mL, 29G X 1/2" | Thermo-Fisher | 8881600145 | |
Depilatory Agent | Amazon | Nair Body Lotion | |
DMEM | Thermo-Fisher | 10-566-016 | |
FBS | Gemini Bio-oroducts | 100-106 | |
Flask | Sigma-Aldrich | CLS430825 | |
Forceps (blunt edge) | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Gauze | Fisher | 13-761-52 | |
Gentamicin | Thermo-Fisher | 15750060 | |
Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
Isofluorane | Penn Vet Supply | VED1350 | |
Isofluorane Vaporizer | VetEquip | 911103 | |
L-glutamine | Thermo-Fisher | 25030081 | |
Optixcare | MidWest Veterinary Supply | 052.50310.3 | |
Paper Tape | Medline | MMM1530Z5 | |
PBS | Thermo-Fisher | 14-190-250 | |
Slide warmer | C&A Scientific | XH-2001 | |
Sterilant (Clidox-S) | Fisher Scientific | NC0332382 (activator) NC9189926 (base) | Needs to be combined according to manufacturer's instructions |
Sterile Alcohol prep pad | Covidien | 6818 | |
Trypsin | Thermo-Fisher | 15090046 | |
Ultrasound gel | Thermo-Fisher | 03-34-1LT | |
Visualsonics Ultrasound Vevo 2100 | Visual Sonics | Vevo 2100 |