Yaralanma sonrası kardiyomiyosit proliferasyonu, miyosit dışı hücre popülasyonlarından gelen ekstrasellüler ipuçlarının senfonisini gerektiren dinamik bir süreçtir. Soy takibi, pasif CLARITY ve üç boyutlu tam montajlı konfokal mikroskopi tekniklerini kullanarak, çeşitli hücre tiplerinin kardiyak onarım ve rejenerasyon üzerindeki etkisini analiz edebiliriz.
Kardiyovasküler hastalık diğer tüm ölüm nedenlerinden daha yüksektir ve dünya çapındaki ölümlerin %31’inden sorumludur. Bu hastalık kardiyak yaralanmada, öncelikle akut miyokard enfarktüsü şeklinde ortaya çıkar. Yaralanma dan sonra çok az esneklik ile, bir kez sağlıklı kardiyak doku fibröz, non-kontrtil skar dokusu ile değiştirilir ve genellikle kalp yetmezliği için bir prelüd olabilir. Rejeneratif tıpta yeni tedavi seçeneklerini belirlemek için, araştırma doğuştan rejeneratif yetenekleri olan omurgalılar üzerinde odaklanmıştır. Böyle bir model organizma yenidoğan fare, sağlam miyokardiyal rejenerasyon ile kardiyak yaralanma yanıt verir. Yenidoğan faresinde klinik olarak alakalı bir yaralanmayı tetiklemek için, sol anterior inen arteri (LAD) tıkamak için, insan kalbinde aterosklerozun tetiklediği miyokard enfarktüsü yansıtan bir ameliyat geliştirdik. Kardiyomiyositler ve miyosit olmayan popülasyonlarda ki değişiklikleri takip etme teknolojisiyle eşleştiğinde, bu model bize kalp yenilenmesini yönlendiren mekanizmaları belirlemek için bir platform sağlar. Yaralanma sonrası kardiyak hücre popülasyonlarında değişiklikler hakkında bilgi edinmek, bir zamanlar doku kesiti ve histolojik inceleme gibi iki boyutlu analizle sınırlı olan ve genellikle bu süreçte dokuya zarar veren yöntemlere dayanıyordu. Ayrıca, bu yöntemler hücre soy değişiklikleri izlemek için yeteneği yoksun, bunun yerine yaralanma yanıtı sadece bir anlık görüntü sağlayan. Burada, soyu izleme modellerinde teknolojik olarak gelişmiş yöntemlerin, tüm organ temizliğinin ve üç boyutlu (3D) tam montajlı mikroskopinin kardiyak onarım mekanizmalarını açıklamak için nasıl kullanılabileceğini anlatıyoruz. Yenidoğan fare miyokard infarktüsü cerrahisi, doku temizleme ve 3Boyutlu tüm organ görüntüleme protokolümüzle, kardiyomiyosit proliferasyonuna neden olan karmaşık yollar çözülerek kardiyak rejenerasyon için yeni tedavi hedeflerini ortaya çıkarabilebilir.
Kalp uzun bir post-mitotik organ olarak kabul edilmiştir, henüz son kanıtlar kardiyomiyosit yenilenmesi yılda yaklaşık% 1 yetişkin insan kalbinde meydana geldiğini göstermektedir1. Ancak, kardiyomiyosit ciro bu düşük oranları yaralanma sonrasında meydana gelen doku büyük kaybı doldurmak için yetersizdir. Bir miyokard enfarktüsü acı bir kalp genellikle kalp yetmezliği ve ani kardiyak ölüm2,,3bir prelüd olarak hizmet veren, bir milyar kardiyomiyosit civarında kaybedersiniz . Dünya çapında kalp yetmezliğinden etkilenen 26 milyondan fazla insan ile, kalp hastalığı4tarafından neden olduğu zararları tersine çevirebilir terapötik için karşılanmamış bir ihtiyaç vardır.
Terapötik ler arasındaki bu boşluğu kapatmak için bilim adamları, yaralanma sonrası endojen yenilenmenin altında yatan evrimsel olarak korunmuş mekanizmaları araştırmaya başladılar. Memeli kardiyak rejenerasyonu üzerinde çalışmak için bir model yenidoğan faresidir. Doğumu takip eden hafta içinde, yenidoğan farelerkardiyak hasarı takiben sağlam bir rejeneratif yanıta sahiptir5. Daha önce neonatal farelerin apikal rezeksiyon5sonrasında kardiyomiyosit proliferasyonu ile kalplerini yenileyebildiklerini göstermiştir. Bu teknik, yenini kardiyak rejenerasyon uyandırmak rağmen, cerrahi insan kalp yaralanmaları için klinik alaka yoksundur. Neonatal fare modelinde bir insan yaralanması taklit etmek için, bir koroner arter tıkanıklığı ile miyokard enfarktüsü neden bir teknik geliştirdik6. Bu teknik sol ventrikül miyokardiyum6,,7kan% 40-50 teslim sorumludur sol anterior inen arter (LAD), cerrahi ligasyon gerektirir. Böylece, cerrahi sol ventrikül duvarının önemli bir bölümünü etkileyen bir enfarktüs sonuçları. Miyokardindeki bu hasar kardiyomiyosit proliferasyonlarını ve kalp yenilenmesini teşvik edecektir5.
Koroner arter oklüzyon cerrahisi kardiyak rejenerasyon iç işleyişini ortaya çıkarmak için son derece tekrarlanabilir ve doğrudan çeviriyöntemi sağlar. Yenidoğan cerrahisi insan kalbinde koroner arter ateroskleroz paralellikler, arterlerin iç duvarları içinde plak birikimi bir oklüzyon ve sonraki miyokard enfarktüsü neden olabilir8. Kalp yetmezliği hastaları için terapötik tedavilerde bir boşluk nedeniyle, LAD bir tıkanıklık yaralanma9aşağıdaki bir yıl içinde% 26’ya ulaşan mortalite oranları ile ilişkilidir , ve sonuç olarak “dul yapıcı” olarak adlandırılmıştır. Terapötik gelişmeler doğru kardiyak yaralanma karmaşık fizyolojik ve patolojik etkilerini yansıtan bir model gerektirir. Yenidoğan fare kardiyak yaralanması için cerrahi protokolümüz, araştırmacıların yaralanma sonrası memeli kalp yenilenmesini işaret eden moleküler ve hücresel ipuçlarını araştırmalarını sağlayan bir platform sağlar.
Son araştırmalar hücre dışı ortam ve kardiyomiyositler çoğalan arasındaki dinamik ilişkiyi vurgulamaktadır. Örneğin, postnatal rejeneratif pencere kalbi çevreleyen hücre dışı matriks sertliği azaltarak uzatılabilir10. Yenidoğan ekstrasellüler matris biyomalzemeler de kardiyak yaralanma11aşağıdaki yetişkin memeli kalplerde kalp rejenerasyonu teşvik edebilir. Ayrıca kardiyomiyosit proliferasyonu eşlik eden bir anjiyojenik yanıt12,13; yenidoğan farenin rejeneratif kalbine özgü kollateral arter oluşumukardiyak rejenerasyonu teşvik etmek için gerekli olduğu gösterilmiştir12. Ayrıca, bizim laboratuvar sinir sinyalizasyonu kardiyomiyosit proliferasyon ve büyüme faktörü düzeyleri modülasyonu yoluyla kalp rejenerasyon düzenler göstermiştir, yanı sıra yaralanma sonrası inflamatuar yanıt14. Bu bulgular kardiyak yaralanmaya yanıt olarak miyosit dışı hücre popülasyonlarının izlenmesi gereğini vurgulamaktadır. Bu amaca ulaşmak için, transgenik fare hatlarındaki Cre-lox rekombinasyon sisteminden yararlanarak floresan muhabir proteinlerin kurucu veya koşullu ifadesini soy takibi için birleştirdik. Ayrıca, hedeflenen hücre popülasyonlarının klonal genişlemesini belirlemek için Cre bağımlı, çok renkli floresan muhabirlerin stokastik ifadesine dayanan Rainbow fare çizgisi ile klonal genişleme desenlerini belirlemek için gelişmiş yöntemler kullanabiliriz15. Neonatal koroner arter oklüzyonu cerrahisi ile soy takibi nin alınması, kardiyak rejenerasyonun karmaşık hücresel mekanizmalarını incelemek için güçlü bir araçtır.
Floresan etiketli hücrelerin soyunu üç boyutlu (3D) tüm organ görüntülemesi ile izlemek geleneksel kesitleme ve rekonstrüksiyon tekniği kullanılarak elde etmek zordur – özellikle hücre popülasyonları kırılgan olduğunda, sinir lifleri veya kan damarları gibi. Optik kesitile organın doğrudan tam montaj görüntüleme yüzeysel hücre popülasyonları yakalayabilir iken, doku içinde derin bulunan yapılar erişilemez kalır. Bu engelleri aşmak için, doku temizleme teknikleri tüm organ dokularının opaklık azaltmak için geliştirilmiştir. Son zamanlarda, önemli gelişmeler Clear Lipid-exchanged Akrilamid-hibrid Rijit Görüntüleme uyumlu Doku hYdrogel (CLARITY) tabanlı yöntemler, hangi lipid ekstraksiyon u geçerek sabit doku temiz16yapılmıştır . Kırılma indisi homojenize etmek ve daha sonra17’yigörüntülerken ışık saçılımını azaltmak için de adımlar atılır. Böyle bir yöntem aktif CLARITY, hangi doku18boyunca deterjan nüfuz elektroforez kullanarak lipid ayrışmasını hızlandırır. Etkili olmasına rağmen, Bu doku temizleme yöntemi pahalı ekipman gerektirir ve doku hasarına neden olabilir, yaklaşım kardiyak sinirler gibi kırılgan hücre popülasyonları ile uyumsuz hale19. Böylece, biz yavaşça deterjan penetrasyon kolaylaştırmak için ısı dayanır pasif CLARITY yaklaşımı, istihdam, bu nedenle karmaşık hücre yapılarının tutulmasına yardımcı20,21.
Pasif BERRAKLIK genellikle aktif CLARITY18daha az verimli olduğu düşünülmektedir , teknik genellikle iki büyük engeller eşlik ettiği gibi: yetersizlik tüm organ derinliği temizlemek için ve yetişkin dokuları temizlemek için gerekli zaman geniş miktarda. Pasif CLARITY yaklaşımımız, yenidoğan ve erişkin kalp dokusunu tamamen temizleyebilecek hızlı bir temizleme işlemi yle bu engellerin her ikisini de aşar. Pasif CLARITY doku temizleme tekniğimiz, erişkin kalbe dağılmış nadir popülasyonlar da dahil olmak üzere çeşitli kardiyak hücre popülasyonlarının görüntülenmesine izin veren bir verimliliğe ulaşmıştır. Temizlenmiş kalp konfokal mikroskopi ile görüntülendiğinde, gelişim, hastalık ve rejenerasyon sırasında hücreye özgü desenleme mimarisi aydınlatılabilir.
Kardiyomiyositler ve miyosit dışı popülasyonlar arasındaki hücre-hücre etkileşimleri, kalbin yaralanma sonrası fibrozis mi yoksa onarım mı geçireceğini belirleyen bir faktördür. Keşifler gösteren çeşitli hücre tipleri, sinirler de dahil olmak üzere14, epikardiyal hücreler24, peritonmakrojlar25, arteriyol1212,13, ve lenfatik endotel hücreleri26, t…
The authors have nothing to disclose.
Bu projenin finansmanı Wisconsin Ortaklık Programı (A.I.M.) ve Amerikan Kalp Derneği Kariyer Geliştirme Ödülü 19CDA34660169 (A.I.M.) tarafından UW Tıp ve Halk Sağlığı Okulu tarafından sağlanmıştır.
1-thioglycerol | |||
6-0 Prolene Sutures | Ethicon | 8889H | Polypropylene Sutures |
Acrylamide | |||
Boric acid | |||
Curved Forceps | Excelta | 16-050-146 | Half Curved, Serrated, 4 in |
Dressing Forceps | Fisherbrand | 13-812-39 | Dissecting, 4.5 in |
Glass Vial | Fisherbrand | 03-339-26A | 12 x 35 mm Vial with Cap |
Histodenz | Sigma-Aldrich | Density gradient medium | |
Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2 mm Cutting Edge |
Large Dissecting Scissors | Fisherbrand | 08-951-20 | Straight, 6 in |
Needle Holder | Fisherbrand | 08-966 | Mayo-Hegar, 6 in |
Paraformaldehyde | |||
Phosphate Buffer | |||
Sharp Forceps | Sigma-Adrich | Z168777 | Fine Tip, Straight, 4.25 in |
Small Dissecting Scissor | Walter Stern Inc | 25870-002 | 30 mm Cutting Edge |
Sodium Azide | |||
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | |||
Tissue Forceps | Excelta | 16050133 | Medium Tissue, 1X2 Teeth |
VA-044 | Wako Chemicals | Water-soluble azo initiator |