Коллекция замороженных регионов мозга грызунов для анализа вниз по течению

Эта работа иллюстрирует вскрытие замороженных областей мозга для извлечения высококачественной нуклеиновой кислоты или белка с помощью ссылки, такие как Аллен Мышь мозга Атлас¹, в качестве руководства. В этом методе мозги замораживаются вспышкой и хранятся при -80 градусов по Цельсию для последующего отделения и вскрытия при сохранении в замороженном состоянии. Этот процесс позволяет исследователю собрать большое количество мозгов за один сеанс, а затем вскрыть их для точного сбора нескольких областей мозга.

Точный сбор областей мозга, представляющих интерес (ROIs) часто требуется при ответе на вопросы, связанные с геном и выражением белка. В то время как фармакология, электрофизиология и оптогенетика могут быть использованы на wildtype или генетически модифицированных грызунов, чтобы помочь прояснить молекулярные изменения, лежащие в основе наблюдаемого поведения^2,3,4, измерение индуцированных изменений в транскриптомах и протеом часто используется для поддержки этих выводов. Такие методы, как количественные обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (RT-qPCR), западные blotting, RNAseq⁵, MAPSeq⁶ и HPLC⁷ являются надежными и относительно низкими по стоимости, что позволяет многим лабораториям для изучения индуцированных молекулярных изменений в малых областях мозга^2,4,5,6.

Есть несколько способов извлечения и очищения нуклеиновой кислоты или белка из областей мозга^{8,,9,,10,,11,,12}. Многие лаборатории собирают мозг регионов путем охлаждения и резки мозгов на льду во время сбора урожая^9,13. Хотя такой подход может привести к высокому качеству нуклеиновой кислоты и белка, он несколько ограничен по времени, поскольку деградация в микроокружении тканей может происходить при таких температурах. Это может быть особенно верно при попытке вскрыть большое количество животных или roIs в один присест. Сохранение образцов замороженных помогает поддерживать молекулы-цели лабила, обеспечивая исследователю время, чтобы тщательно сравнить ориентиры с обеих сторон каждого раздела в попытке собрать относительно чистые образцы. Лазерный захват является еще одним способом сбора ткани для РНК или анализа белка из областей мозга¹⁰. Эта процедура превосходит механическое вскрытие в том, что очень маленькие и неправильной формы ROIs могут быть определены и изолированы. Однако лазерный захват ограничен использованием дорогостоящего оборудования и реагентов, занимает много времени, а также может быть более восприимчив к деградации образцов.

Вскрытие микропунда на замороженных тканях не ново. Ранние работы Миклоша Палковича и других подробно описывают основные методы^14,,15. Эта презентация в значительной степени соответствует первоначальной работе, с некоторыми улучшениями для облегчения эффективности и сокращения расходов на оборудование, необходимое. Например, участки мозга сделаны в замороженном мозговом блоке, а не на криостате. Это приводит к более толстым секциям, что уменьшает количество секций, необходимых для сбора образцов окупаемое окупаемое инвестиций. Этот метод также вскрывает образцы на замороженной стеклянной пластине, которая сидит на сухом льду в изолированной коробке. Это создает под-замораживания этапе на скамейке, на которой работать. Разделы, расчлененные таким образом, легко манипулируют, что позволяет исследователю сравнивать обе стороны каждого раздела со ссылкой, чтобы ограничить загрязнение из регионов за пределами желаемой рентабельности инвестиций.

Преимущества этого протокола в том, что 1) мозг находится в замороженном состоянии на протяжении всего процесса, что помогает сохранить белок и нуклеиновой кислоты и дает исследователю время, чтобы тщательно собирать ROIs, и 2) реагенты, необходимые являются недорогими и находятся в большинстве лабораторий молекулярной биологии. В этом процессе целые мозги разделены до 0,5-1,0 мм в матрице мозга и помещаются на замороженную стеклянную пластину, которая постоянно охлаждается сухим льдом. Ориентиры, найденные в Атласе мозга Аллена¹ или других атласах мозга^16,17 используются для выявления областей, представляющих интерес, которые затем вскрыты с помощью либо холодный пунш или скальпель. Поскольку ткань никогда не оттаяла, регионы, собранные таким образом, обеспечивают высокое качество РНК и белка для анализа ниже по течению.