Verzameling van bevroren knaagdierhersengebieden voor downstreamanalyses

Dit werk illustreert de dissectie van bevroren hersengebieden voor de extractie van hoogwaardig nucleïnezuur of eiwit met behulp van een referentie, zoals de Allen Mouse Brain Atlas¹, als een gids. In deze techniek worden hersenen flash-bevroren en opgeslagen bij -80 °C voor latere sectie en ontleding terwijl ze in een bevroren toestand worden gehouden. Dit proces stelt de onderzoeker in staat om een groot aantal hersenen in één sessie te oogsten en ze later te ontleden voor een nauwkeurige verzameling van meerdere hersengebieden.

De nauwkeurige verzameling van hersengebieden van belang (ROI’s) is vaak nodig bij het beantwoorden van vragen met betrekking tot gen- en eiwitexpressie. Terwijl farmacologie, elektrofysiologie en optogenetica kunnen worden gebruikt op wildtype of genetisch gemodificeerde knaagdieren om te helpen verduidelijken moleculaire veranderingen die ondersteunen waargenomen gedrag^2,3,4, de meting van geïnduceerde veranderingen in transcriptomen en proteomen wordt vaak gebruikt om deze bevindingen te ondersteunen. Technieken zoals kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (RT-qPCR), westelijke blotting, RNAseq^5,MAPSeq⁶ en HPLC⁷ zijn robuust en relatief laag in kosten, waardoor veel laboratoria om geïnduceerde moleculaire veranderingen te bestuderen binnen kleine hersengebieden^2,4,5,6.

Er zijn verschillende manieren om nucleïnezuur of eiwit uit hersengebieden^8,9,10,11,12te extraheren en te zuiveren. Veel laboratoria oogsten hersengebieden door het koelen en snijden van hersenen op ijs op het moment van oogst^9,13. Hoewel deze aanpak kan resulteren in hoge kwaliteit nucleïnezuur en eiwit, is het enigszins tijd-beperkt als afbraak binnen de micro-omgeving van het weefsel kan plaatsvinden bij deze temperaturen. Dit kan met name het geval zijn bij een poging om een groot aantal dieren of ROI’s in één vergadering te ontleden. Het houden van monsters bevroren helpt handhaven van bieldoelmoleculen, terwijl de onderzoeker de tijd om zorgvuldig te vergelijken oriëntatiepunten aan beide zijden van elke sectie in de poging om relatief zuivere monsters te verzamelen. Laser capture is een andere manier om weefsel te verzamelen voor RNA of eiwitanalyse uit hersengebieden^10. Deze procedure is superieur aan mechanische dissectie in die zin dat zeer kleine en onregelmatig gevormde ROI’s kunnen worden geïdentificeerd en geïsoleerd. Echter, laser capture wordt beperkt door het gebruik van dure apparatuur en reagentia, is tijdrovend en kan ook meer vatbaar zijn voor afbraak van monsters.

Micropunch dissectie op bevroren weefsels is niet nieuw. Vroege papers van Miklos Palkovits en anderen beschrijven de basistechnieken in detail^14,15. Deze presentatie volgt grotendeels het oorspronkelijke werk, met enkele verbeteringen om de efficiëntie te vergemakkelijken en de kosten van de benodigde apparatuur te verlagen. Bijvoorbeeld, hersensecties worden gemaakt in een bevroren hersenblok in plaats van op een cryostat. Dit produceert dikkere secties die het aantal secties die nodig zijn om ROI monsters te verzamelen vermindert. Deze methode ontleedt ook monsters op een bevroren glasplaat die op droogijs in een geïsoleerde doos zit. Dit levert een subvriesfase op de bank waarop u moet werken. Secties die op deze manier worden ontleed zijn gemakkelijk te manipuleren, waardoor de onderzoeker beide zijden van elke sectie kan vergelijken met een verwijzing om besmetting van regio’s buiten de gewenste ROI te beperken.

Voordelen van dit protocol zijn dat 1) de hersenen wordt gehouden in een bevroren toestand gedurende het hele proces, die helpt bij het behoud van eiwitten en nucleïnezuur en geeft de onderzoeker de tijd om zorgvuldig te oogsten ROI’s, en 2) de benodigde reagentia zijn goedkoop en worden gevonden in de meeste moleculaire biologie labs. In dit proces worden hele hersenen in een hersenmatrix tot 0,5-1,0 mm doorsneden en op een bevroren glasplaat geplaatst die continu wordt gekoeld met droogijs. Oriëntatiepunten gevonden in de Allen Brain Atlas¹ of andere hersenen atlassen^16,17 worden gebruikt om gebieden van belang te identificeren, die vervolgens worden ontleed met behulp van een koude punch of scalpel. Omdat het weefsel nooit ontdooid is, leveren regio’s die op deze manier worden geoogst hoogwaardige RNA en eiwit voor downstream analyses.