Sammenfatning af Suckling-til-fravænning overgang in vitro ved hjælp af føtale tarm Organoider

Denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, der er oprettet af den etiske komité for dyreforsøg ved universitetet i Amsterdam, i fuld overensstemmelse med den nationale lovgivning om dyreforskning efter EU-direktiv 2010/63/EU om anvendelse af dyr til videnskabelige formål (ALC312). 1. isolering af føtal små tarm organoider Ofrer E18-E20 fostre ved hugning med kirurgisk saks, i henhold til de godkendte etiske regler. Umiddelbart efter eutanasi, omhyggeligt skåret åbne underlivet af fosteret med tarm saks og fjerne hele tarmen.Bemærk: isolationen skal udføres med tarme mellem E18 og E20 for at opnå den rette overgang til fravænning og modning in vitro. Med to små pincet, strække tarmen. Ved hjælp af maven og tillægget som hjælpelinjer skæres den proksimale og distale del af tyndtarmen ud.Bemærk: Hvis dissektion er gjort omhyggeligt, er det muligt at isolere tyktarmen samt. Skær den fra hinanden ved hjælp af appendiks som vejledning (figur 1). Gør tarmen åben i længderetningen: Fastgør tarmen ved hjælp af et barberblad placeret i længderetningen og træk tarmen ved at skubbe pincet (en arm af pincet på hver side af barberbladet) langs barberbladet. Derefter skæres den åbne tarm i 1 cm stykker. Forbered 2 50 mL rør med 10 mL iskold fosfat-Buffered saltvand (PBS). Den proksimale og distale del af tyndtarmen (og eventuelt kolon) overføres separat til rørene. Hold rørene på is, mens du dissekting tarmene af yderligere mus. Saml alle intestinale dele af et kuld sammen i samme rør.Bemærk: et kuld har normalt 6-10 fostre. Tarmene af alle fostre skal kombineres. Dette beløb bør være nok til at give 4-8 brønde med organoider, i en 48-brønd plade, pr tarm del. Fortsæt med organoid isolation som tidligere beskrevet11. Kort sagt, vask tarm stykker med iskold PBS, Inkuber med 2 mM ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) i 30 minutter ved 4 °C, dissociér krypterne fra vævet ved hårdt at vaske brikkerne med iskold PBS + 10% føtal kalveserum (FCS), Filtrer ved hjælp af en 70 μm cellefilter og centrifuge for at indsamle krypterne ved 150 x g i 5 min ved 4 °c. Plade 4 til 8 brønde med Krypter i ekstracellulære matrix gel, afhængigt af pellet størrelse, i en varm 48-brønd plade. Brug 20 μL af Krypter suspenderet i ekstracellulær matrix gel per brønd. Lad ekstracellulær matrix gel størkne i en 37 °C inkubator i 10 min.Bemærk: i betragtning af at kun 40% til 50% af isolerede Krypter danner organoider, sigter efter en tæthed på 250 til 300 organoider per brønd. Først tilsættes mindre ekstracellulære matrix gel end nødvendigt. Kig under mikroskop efter platting den første brønd til at analysere, om tætheden af de isolerede Krypter er ideel. Hvis det er nødvendigt, tilsættes mere ekstracellulær matrix gel. I mellemtiden forberedes ENR medium: 14 mL avanceret Dulbecco’s modificerede Eagle medium/skinke F-12 (DMEM/F12) 1:1 + + + (suppleret med 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethansulfonsyre (HEPES) 1x, L-glutamin 0,01 M og 0,2 e/mL penicillin/streptomycin), 4 mL Noggin-konditionerede medier, 2 mL Rspondin-konditionerede medier, 400 μL af B27 supplement 1x, 200 μL af N2 supplement 1x, 50 μL af 1,25 mM n-acetylcystein, 20 μL af 0,05 μg/mL epidermal vækstfaktor (EGF).Bemærk: når dyrkning kolon organoider, supplere med 50% WNT konditioneret medier. Tilsæt 250 μL ENR-medium pr. brønd. 2. dyrkning af fostrets organoider Skift mellem kulturerne 3 gange om ugen. Modning af organoider opnås efter 1 måned af kultur. På dag 3 efter hver passage tælles antallet af sfæroider og organoider ved hjælp af et optisk mikroskop. Kvantificere mindst 3 brønde per tilstand og alle de organoider til stede i hver brønd.Bemærk: antallet af sfæroider reduceres med tiden, mens antallet af organoider øges (figur 2). Passere organoider en gang om ugen ved mekanisk dissociation som beskrevet nedenfor. Fjern mediet, og tilsæt 1 mL iskoldt avanceret DMEM/F12 1:1 + + +. Saml alle ekstracellulære matrix gel med organoider i et 15 mL rør. Brug en 200 μL spids oven på et 1000 μL filter spids, og pipetten op og ned 20 gange for at forstyrre organoiderne. Centrifugeres ved 150 x g i 5 minutter ved 4 °c. Supernatanten kasseres, og pelleten opslæmmes i 20 μL ekstracellulær matrix gel pr. brønd. Normalt, fostrets organoider kan udvides i en 1:2 ratio. Lad ekstracellulær matrix gel størkne i 5-10 min. Tilsæt 250 μL ENR-medium pr. brønd. 3. modnings analyse på RNA-og Proteinniveau Analyser kultur hver 3 dage efter hver passage, i en periode på 1 måned (dvs. tid, hvor fuldstændig modning er opnået) (figur 3).Bemærk: føtal organoid kultur er dynamisk (film 1) og for at undgå variation fra den normale regenerering af organoider efter mekanisk afbrydelse, er det nødvendigt altid at indsamle prøver på samme dag efter passage. RNA-isolation Saml 3 brønde af organoider med 200 μL RNA-lyse buffer for hver brønd suppleret med 2 μL β-mercaptoethanol. Efter tilsætning af RNA lysis buffer + β-mercaptoethanol til brønden, Sørg for at alle ekstracellulære matrix gel med organoider overføres til en RNase-fri 1,5 mL rør. Vortex kraftigt og opbevares ved-80 °C i højst 1 måned. Isoler RNA ved hjælp af kommercielt tilgængelige silica spin kolonne kits. For at øge RNA kvalitet, efter vask trin tilsættes 500 μL 80% EtOH og forsigtigt blandes ved at invertere søjlen. Centrifuge i 2 min ved 11.000 x g for at tørre søjlen helt.Bemærk: Sørg for at vaske indersiden af låget af røret med 80% EtOH ved at svirpe røret på hovedet tre til fem gange for at slippe af med alle spor af guanidin thiocyanate. For at øge RNA-udbyttet skal du vente 1-2 min efter påføring af RNase-frit vand før centrifuge. Re-elute RNA ved at anvende den første flow-through eluatet til kolonnen en anden gang.Bemærk: isoleret RNA-kvalitet er tilstrækkelig til brug i Genome-dækkende udtryks analyse. Kontroller, om RNA-integritets nummeret er over 8. Protein isolering Saml 5 brønde af organoider ved hjælp af 250 μL iskoldt celle genvindings løsning i 1 15 mL rør. Inkuber i mindst 30 minutter på is for at opløse den ekstracellulære matrix gel (dette vil reducere proteintilførslen fra ekstracellulær matrix gel). Vask med iskold PBS. Tilsæt 250 μL cellelyse buffer og opbevar ved-80 °C.Bemærk: efter sonikering kan prøverne bruges til at detektere enzymaktivitet eller til vestlige blots. Immun Saml 2 brønde af organoider ved hjælp af 250 μL iskoldt celle genvindings løsning i et 15 mL rør. Inkuber i mindst 30 minutter på is for at opløse den ekstracellulære matrix gel (dette vil reducere farvnings baggrunden). Vask med iskold PBS. Organoiderne fastsættes med 500 μL af 4% paraformaldegyde (PFA) i 1 time ved 4 °C. Vask med iskold PBS. Fortsæt til hel-organoid immunofluorescenstest eller til paraffin indlejring, ifølge offentliggjorte protokoller12.Bemærk: Brug en plastik Pasteur-pipette til at håndtere organoiderne. Dette vil undgå forstyrrelse af dets struktur. 4. effekt af extrinsisk faktor (dexamethason som et eksempel) på organoid modningsproces På dag ét af kulturen tilsættes 0,01 M dexamethason til organoider. Organoiderne med dexamethason inkubates i hele kulturmåneden ved at tilføje ny dexamethason, hver gang mediet skiftes. Analyse af genekspression Isoler RNA som beskrevet ovenfor. Syntetisere, på samme tid, cDNA af alle prøver, der skal sammenlignes (behandlet og ubehandlet). Fortsæt med den foretrukne qRTPCR-metode. Brug GeNorm til at identificere de to mest stabile reference gener, hver gang der anvendes en ny behandling på fostrets organoider. Brug det geometriske gennemsnit af de to valgte reference gener til beregning af relative udtryk.Bemærk: forslag til reference gener til at teste for muse føtale organoider: cyclophilin, Gapdh, βactin, 36b4, Hprt, Rpl4, Rpl32, Ppib og TBP. For at undersøge, hvordan en bestemt ydre faktor påvirker føtal modning efter fødslen, bør alle følgende gener evalueres. Undersøg om føtal markører laktase (LCT), argininosuccinat syntase 1 (Ass1), B lymfocyt-induceret modning protein 1 (Blimp-1) og neonatal FC receptor (fcrn) fald i ekspression i de første to uger af kulturen og er fraværende for den resterende kulturtid (figur 4c). Analysér, om dette mønster ændres. Kontroller, om voksne markører sucrase-isomaltase (SIS), arginase 2 (arg2), Trehalase (treh) og lysozym (lyz) stigning i ekspression efter to ugers kultur (figur 4d). Analysér, om dette mønster ændres af den eksterne faktor.Bemærk: dexamethason er en ekstern faktor, der kan fremskynde modning af føtale organoider og kan bruges som en positiv kontrol i alle forsøg med henblik på at teste andre ydre faktorer. Enzymaktivitet analyse Isoler protein som beskrevet ovenfor. Opdage tarm i aktivitet i henhold til protokoller offentliggjort af dahlqvist og messer13,14. Forbered 0,625 M maleic-buffer pH 6,0 (hold i 3 måneder ved 4 °C). Ved hjælp af denne buffer, forberede 0,05 M lactose (tilsæt p-hydroxymercuribenzoatnatrium som stabilisator til at hæmme lysosomale p-galactosidase aktivitet); 0,05 M maltose; 0,05 m saccharose og 0,05 M trehalose.Bemærk: alle disse opløsninger kan opbevares i 5 dage ved 4 °C. Hold på isen, mens du forbereder analysen. Forbered analysestandarder ved at fortynde 5,56 m glucoseopløsning med ultrarent vand for at opnå opløsninger med følgende koncentrationer: 0,125 M; 0,1 M; 0,075 M; 0,05 m og 0,025 M.Bemærk: opløsningen er stabil i mindst 3 måneder ved 4 °C. Der inkubates i en 96-brønd plade til 60 min ved 37 °C:-30 μL organoid-lysat med 30μL lactose-30 μL organoid-lysat med 30μL saccharose-30 μL 10 gange fortyndet organoid-lysat med 30 μL maltose-30 μL af fem gange fortyndet organoid-lysat med 30 μL trehalase-30 μL ufortyndet organoid-lysat med 30 μL maleinsyre som stikprøve baggrund-30 μL af hver glukose standard-30 μl ultrarent vand, som tomt-30 μl positiv kontrol (Optimer fortynding; lyseres føtal tarm væv kan anvendes som kontrol for lactaseaktivitet, mens lyseres voksen tarm væv kan anvendes som kontrol for sucrase, maltase og trehalase)Bemærk: fortynding af prøverne skal foretages med cellelyse buffer. Opbevar prøverne og pladen på isen, mens analysen forberedes. For at bestemme mængden af glucose, der produceres af de enzymer, der er til stede i organoid lysatet efter inkubation med deres respektive substrater, tilsættes hurtigt 200 μL PGO-farveopløsning og måle absorbans ved 450 Nm hver 5 min for 30 min ved 37 °C.Bemærk: gør PGO-farveopløsning frisk. Brug 10 U/mL glucoseoxidase, 2 U/mL peroxidase og 7,88 mmol/L o-dianisidin i 0,5 mol/L Tris-HCl buffer ved pH 7,0. Opløsningen skal være ved stuetemperatur, når den tilsættes til pladen. Beregn aktivitet i henhold til glucose standard og korrigere for den samlede mængde af protein (bestemt af bicinchonininsyre assay (BCA)). Enzymaktivitet skal udtrykkes som μM glucose/μg protein · min-1 (figur 5b).Bemærk: mål arginase aktivitet ved hjælp af en kommercielt tilgængelig arginase aktivitet assay kit.