यह प्रोटोकॉल 30 दिनों के लिए सुसंस्कृत माउस लेट भ्रूण आंतों के ऑर्गेनॉइड का उपयोग करके विट्रो में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण की नकल करने का वर्णन करता है।
दूध पिलाने की अवधि के अंत में, कई स्तनधारी प्रजातियों आंतों के एपिथेलियम में बड़े बदलावों से गुजरना पड़ता है जो ठोस भोजन को पचाने की क्षमता से जुड़े होते हैं। इस प्रक्रिया को दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण और परिणाम वयस्क एपिथेलियम के साथ नवजात एपिथेलियम के प्रतिस्थापन में कहा जाता है जो मेटाबोलिक और रूपात्मक समायोजन के साथ हाथ में जाता है। ये जटिल विकासात्मक परिवर्तन एक आनुवंशिक कार्यक्रम का परिणाम हैं जो आंतों के एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए आंतरिक है, लेकिन कुछ हद तक बाह्य कारकों द्वारा संग्राहक किया जा सकता है। देर से भ्रूण अवधि से माउस प्राथमिक आंतों के एपिथेलियल कोशिकाओं की लंबे समय तक संस्कृति, विट्रो में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण को फिर से तैयार करती है। यहां, हम माउस भ्रूण आंतों ऑर्गेनॉइड संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो इस प्रक्रिया को विट्रो में मॉडल करने के लिए सबसे उपयुक्त है। हम समय के साथ दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण से जुड़े आंतों के कार्यों के परिवर्तन की निगरानी के लिए डिज़ाइन किए गए कई उपयोगी परखों का वर्णन करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम एक बाह्य कारक का एक उदाहरण शामिल है जो विट्रो में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण को प्रभावित करने में सक्षम है, जो विट्रो में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण के समय को कम करने के प्रतिनिधित्व के रूप में है। इस इन विट्रो दृष्टिकोण का उपयोग दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण के आणविक तंत्र ों के साथ-साथ इस प्रक्रिया के मॉड्यूलर का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, अनुसंधान में पशु नैतिकता के संबंध में, इस इन विट्रो मॉडल द्वारा आईएन वीवो मॉडल की जगह पशु प्रयोगों को परिष्कृत करने में योगदान देता है और संभवतः आंत परिपक्वता प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए जानवरों के उपयोग में कमी करने के लिए।
चूहों और पुरुषों सहित कई स्तनधारी प्रजातियों में, नवजात आंत में कई विशेषताएं हैं जो पूरी तरह से परिपक्व आंतों के एपिथेलियम से अलग हैं। ये विशेषताएं नवजात आंत्रप्रेन्योर्स को दूध को पचाने और अवशोषित करने की सुविधा प्रदान करती हैं, जिसमें उच्च वसा और कम कार्बोहाइड्रेट होते हैं, जिसमें लैक्टोज प्रमुख कार्बोहाइड्रेट के रूप में होता है। नवजात आंतों की एपिथेलियल कोशिकाओं की ब्रश सीमा दूध को डिसैकराइड लैक्टोज को पचाने के लिए डिसैकराइड्स लैक्टेस-फ्लोरिजिन हाइड्रोलेस (एलसीटी)1 को व्यक्त करती है। दूध पिलाने की अवधि के बाद, आंत्रविज्ञान ठोस भोजन को पचाने के लिए अनुकूल होते हैं जो जटिल कार्बोहाइड्रेट से समृद्ध होते हैं और वसा में कम होते हैं। यह लैक्टेज से लेकर सुक्रैसे-आइसोमालटीज़ (सिस) और ट्रेहलसे (ट्रेह) तक ब्रश सीमा असक्धारी अभिव्यक्ति में एक स्विच द्वारा प्रकट होता है, जो ठोस भोजन2में मौजूद अधिक जटिल कार्बोहाइड्रेट को पचा सकता है। एक और मेटाबॉलिक स्विच दूध में आर्जिनिन की कम एकाग्रता से संबंधित है। आर्जिनिन की आवश्यकता प्रदान करने के लिए, नवजात आंत्रप्रेन्योट्स आर्जिनिन बायोसिंथेसिस, आर्गिनोक्सिनेट सिंथासे-1 (Ass1) में दर सीमित एंजाइम को व्यक्त करते हैं, आर्गिनाइन3का संश्लेषण करने के लिए। इसके विपरीत, वयस्क आंत्रप्रेन्योट्स आर्गिनेस 2 (एआरजी2) को व्यक्त करते हैं, जो एक एंजाइम जो आर्जिनिन को कैटाबोलकरने में सक्षम है जो ठोस खाद्य पदार्थों में प्रचुर मात्रा में है। इसके अलावा, नवजात आंतों के एपिथेलियम इम्यूनोग्लोबुलिन (एफसीआरएन) के लिए नवजात एफसी रिसेप्टर को व्यक्त करता है, जो दूध से मातृ आईजीजी के अवशोषण को परिसंचरण/रक्त प्रवाह4में मध्यस्थता करता है । एफसीआरएन की अभिव्यक्ति दूध पिलाने के लिए प्रातः संक्रमण5के दौरान काफी गिरावट आती है । चूहों में, पनेथ कोशिकाओं की परिपक्वता पोस्टटल ली जाती है, संयोग से क्रिप्टोप्स के गठन और परिपक्वता के साथ, और एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड्स लिसोसोम (लायज़) और डिफेन्सिन6की अभिव्यक्ति की विशेषता है।
ये सभी परिवर्तन दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण का हिस्सा हैं, जो चूहों में एक महीने की उम्र तक जन्म के बाद धीरे-धीरे होने वाली एक प्रक्रिया है, जब आंतों का एपिथेलियम अपने परिपक्व वयस्क राज्य तक पहुंचता है। दूध पिलाने के लिए प्रातः संक्रमण आंतरिक रूप से विनियमित और विकास आंत ट्यूब में सेट है । ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर बी लिम्फोसाइट-प्रेरित परिपक्वता प्रोटीन-1 (ब्लींप-1) इस आंतरिक परिपक्वता प्रक्रिया7में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । ब्लींप-1 नवजात एपिथेलियम में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है, जबकि इसकी अभिव्यक्ति कम हो जाती है और दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण के दौरान खो जाती है और इसलिए नवजात आंतों के एपिथेलियम के विश्वसनीय मार्कर के रूप में काम कर सकती है। एक आंतरिक प्रक्रिया होने के बावजूद, दूध पिलाने के लिए प्रातः संक्रमण बाहरी कारकों द्वारा संग्राहक किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, कोर्टिसोल, डेक्सेस्टेथासोन के सिंथेटिक एनालॉग को वीवो8,9में आंत परिपक्वता में तेजी लाने के लिए जाना जाता है।
वर्तमान इन विट्रो मॉडल दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण सहित आंतों के एपिथेलियल परिपक्वता का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, वयस्क एपिथेलियल सेल लाइनों और/या वयस्क ऑर्गेनॉइड का उपयोग करता है जो वयस्क आंतों के विशेषण की विशेषताओं को सहन करते हैं । हमने हाल ही में दिखा दिया है कि प्राथमिक आंतों के एपिथेलियल कोशिकाएं देर से भ्रूण आंत परिपक्व से अलग होती हैं और ऑर्गेनोइड10के रूप में विट्रो में बढ़ने पर दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण को फिर से तैयार करती हैं। हमने आगे दिखाया कि विट्रो में यह आंत परिपक्वता प्रक्रिया वीवो की तरह ही गति से होती है । अंत में, हमने वीवो अध्ययनों में वर्णित समान फैशन में परिपक्वता प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए डेक्सेथेथासोन का उपयोग किया।
यहां, हम माउस देर से भ्रूण आंतों ऑर्गेनॉइड के अलगाव और संस्कृति के लिए एक सटीक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं। हम विट्रो में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण की निगरानी करने के लिए लंबे समय तक ऑर्गेनॉइड संस्कृति और तरीकों के लिए नमूने एकत्र करने के पसंदीदा तरीके का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग आंतों के एपिथेलियाल परिपक्वता और इस प्रक्रिया के मॉड्यूलर के इन विट्रो अध्ययनों के लिए किया जा सकता है और परिणामस्वरूप डेटा की गुणवत्ता और अनुवादमूल्य में वृद्धि होती है और पशु उपयोग में कमी आती है।
यह प्रोटोकॉल विट्रो में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण की नकल करने के लिए लंबे समय तक देर से भ्रूण आंतों के ऑर्गेनॉइड की बागवानी का वर्णन करता है। परिपक्वता की प्रक्रिया वीवो में गति के बराबर होती है और संस्कृति में एक महीने के बाद पूरी होती है। मात्रात्मक आरएनए और प्रोटीन तकनीकों का उपयोग करके इस संस्कृति के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण विस्तृत हैं।
इस प्रोटोकॉल में, E18-E20 माउस भ्रूण से प्राथमिक आंतों की कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल के लिए ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्राथमिक माउस कोशिकाओं का विकासात्मक चरण विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। पहले के विकास के चरण का उपयोग करने से आंतों के गोलाकार का उत्पादन होगा जो लंबे समय तक अपनी विशिष्ट भ्रूण जीन अभिव्यक्ति को बनाए रखते हैं , जिसमें वयस्क ऑर्गेनॉइड15,16में सीमित संक्रमण होता है । केवल देर से भ्रूण चरण स्फेरॉइड ही विट्रो10में वयस्क ऑर्गेनोइड में जाने में सक्षम हैं । आंत परिपक्वता पर बाह्य कारकों के प्रभाव के संबंध में अवसर की खिड़की को अधिकतम करने के लिए, देर से भ्रूण चरण से आंतों की सिफारिश की जाती है और जन्म के पिल्ले से आंतों की सिफारिश की जाती है जो रोगाणुओं और मां के दूध के संपर्क में आते हैं। बताया गया है कि कुछ जीवाणु मेटाबोलाइट्स और दूध के घटक परिपक्वता प्रक्रिया17के संशोधक के रूप में कार्य कर सकते हैं ।
जन्म से वयस्कता तक पूरी परिपक्वता का अध्ययन करने के लिए एक महीने तक संस्कृति को बनाए रखने के लिए पर्याप्त मात्रा में कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, जबकि डाउनस्ट्रीम विश्लेषण ों के लिए नमूनों का संग्रह, 6-8 भ्रूण से आंतों को शुरू सामग्री के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। संस्कृति पैदा करने के लिए उसी विकासके चरण से भ्रूण का इस्तेमाल करना पसंद किया जाता है। हम विभिन्न कूड़े को पूल करने की सिफारिश नहीं करते हैं क्योंकि विकासात्मक चरण में मामूली अंतर परिपक्वता जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकता है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल आंत के विभिन्न क्षेत्रों की विकासात्मक विशेषताओं को बनाए रखने के लिए समीपस्थ और डिस्टल छोटी आंत से ऑर्गेनोइड उत्पादन के लिए जिम्मेदार है। एक विकल्प के रूप में, पूरी आंत को विशिष्ट मार्कर की वृद्धि/कमी अभिव्यक्ति के संबंध में समग्र परिपक्वता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । बाद के मामले में, कम भ्रूण संस्कृति शुरू करने के लिए आंतों की कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
यह प्रोटोकॉल त्रि-आयामी ऑर्गेनोइड संस्कृतियों का उपयोग करके विकसित किया गया है। चूंकि ऑर्गेनॉइड संस्कृति में गतिशील विकास से गुजरते हैं, इसलिए पासिंग के बाद एक ही समय बिंदु पर डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए नमूने एकत्र करना महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में, हमने पारित होने के बाद 3 दिन का चयन किया है, क्योंकि यह दो विभाजनों के बीच मध्यम समय का प्रतिनिधित्व करता है जिस पर ऑर्गेनॉइड में मजबूत कलियां होती हैं और कोई कोशिका मृत्यु नहीं होती है। पासिंग के बाद एक वैकल्पिक समय बिंदु का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यह पूरे प्रयोग के दौरान सुसंगत होना चाहिए। हम एक मार्ग के बाद 7 दिनों से अधिक समय तक ऑर्गेनॉइड बढ़ने की सिफारिश नहीं करते हैं, क्योंकि ऑर्गेनोइड ल्यूमेन में मृत्यु कोशिकाओं की वृद्धि परिणामों को प्रभावित कर सकती है।
अपने प्रयोगों में, हमने एक बाह्य कारक के उदाहरण के रूप में डेक्सेथासोन का उपयोग किया है जिसे वीवो9,18में आंतों की परिपक्वता में तेजी लाने के लिए साहित्य में दिखाया गया हैऔरसबसे अच्छा अध्ययन किया गया है। डेक्सेथासोन जीनोमिक और नॉन-जीनोमिक दोनों मार्गों के माध्यम से इसके प्रभाव डालती है। उदाहरण के लिए, जीनोमिक विनियमन के स्तर पर, एसआईएस एमआरएनए स्तरों की असामयिक वृद्धि देखी जा सकती है। गैर-जीनोमिक स्तर पर, हम ट्रेहल्स जैसे पाचन एंजाइमों की गतिविधि में परिवर्तन का निरीक्षण करते हैं। दोनों ही वीवो19में देखे गए आंतों के ब्रश सीमा एंजाइमों पर सुक्रैज जीन सक्रियण और गैर-जीनोमिक सक्रिय प्रभाव पर डैक्सेथासोन के वर्णित विशिष्ट पहलुओं के अनुसार हैं । तथ्य यह है कि सिंथेटिक ग्लूकोकॉर्टिकोइड जैसे बाह्य कारक, ऑर्गेनोइड संस्कृति में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण के कुछ पहलुओं को मिला सकते हैं, इसी तरह विवो में वर्णित है, आगे आंत परिपक्वता के विभिन्न प्रकार के मॉड्यूलर की जांच के लिए माउस भ्रूण आंतों ऑर्गेनॉइड को एक मॉडल के रूप में स्थापित करता है।
भले ही मानव आंतों के एपिथेलियम की रूपात्मक परिपक्वता 22 सप्ताह के गर्भावधि चरण में गर्भाशय में पूरी हो जाती है, आंतों की बाधा कार्य बचपन तक खिलाने के प्रकार, माइक्रोबायोटा के विकास और के साथ घनिष्ठ संबंध में परिपक्व होता है प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया। इन विकासात्मक चरणों में मानव ऊतकों की सीमित उपलब्धता के कारण, इन विट्रो मूत्र मॉडल का ट्रांसलेशनल मूल्य आंतों की परिपक्वता को कम करने में सक्षम कारकों की उच्च थ्रूपुट स्क्रीन की संभावना में निहित है, एक प्रक्रिया के बीच संरक्षित स्तनपायी चूसने।
महत्वपूर्ण बात, अनुसंधान में पशु नैतिकता के संबंध में, यह मॉडल पशु प्रयोगों को परिष्कृत करने में योगदान दे सकता है क्योंकि इसमें जानवरों पर किए गए हस्तक्षेप शामिल नहीं हैं । संस्कृति के एक या दो समय के बिंदुओं पर अनुसंधान प्रश्नों को नया स्वरूप देकर पशुओं की संख्या को और कम किया जा सकता है जो एक संस्कृति के भीतर कई घटकों के परीक्षण की अनुमति देगा ।
The authors have nothing to disclose.
कोई नहीं.
Advanced DMEM/F12 1:1 | Invitrogen | 12634-028 | |
Arginase Activity Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK112-1KT | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 100x |
BCA protein assay Kit | Fisher | 10741395 | |
Cell lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9803S | |
Cell Recovery Solution | Corning B.V. | 354253 | |
Cell strainer 70µM | BD/VWR | 734-0003 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
EDTA | Merck | 10,84,18,250 | EDTA Titriplex III |
EGF | Invitrogen | PMG8045 | |
Ethanol | Merck | 1,00,98,31,000 | |
Glucose solution | Sigma-Aldrich | G6918 | |
Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | 100x |
Hepes | Invitrogen | 15630-056 | 1M |
Isolate II RNA Mini Kit | Bioline | BIO-52073 | |
Lactose | Sigma-Aldrich | L3625 | a-Lactose monohydrate |
Maleic Buffer | Sigma-Aldrich | M0375 | Maleic acid |
Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | D-(+)-Maltose monohydrate >99% |
Matrigel | Corning B.V. | 356231 | Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix |
Millipore water | N.A. | ||
N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100x |
n-Acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Noggin-conditioned media | Homemade | ||
o-dianisidine | Sigma-Aldrich | 191248 | |
PBS | Homemade | ||
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 0,2 U/mL |
PGO-enzyme preparation | Sigma-Aldrich | P-7119-10CAP | capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase |
p-hydroxymercuribenzoate sodium | Sigma-Aldrich | 55540 | |
Rspondin-conditioned media | Homemade | ||
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T5251 | D-Trehalose dihydrate |
Tris-HCl Buffer | Homemade | ||
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |