후성유전학 기반 정량적 PCR을 이용한 면역 세포 정체성 및 순도 측정

모든 인간 샘플은 인간 연구 윤리에 대한 지침에 따라 상업적 출처에서 얻어졌습니다. 1. 게놈 DNA 격리 참고: 게놈 DNA 분리는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 정제된 T 세포 또는 기타 조혈 세포 유형과 같은 임의의 조혈 세포로부터 시판되는 키트(재료 표참조)를 사용하여 수행됩니다. 본 실험에서, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 T 세포는 3개의 상이한 인간 공여자로부터 사용하였다. 원원관에 1-2 x 106 조혈 세포를 놓고 원심 분리기를 400 x g에서 10 분 동안 놓습니다. 상급을 완전히 흡인합니다. 350 μL의 용해/결합 버퍼를 시료에 넣고 55°C에서 10분 동안 배양합니다. 50 μL의 단백질나제 K(20 mg/mL)를 350 μL의 세포 현탁액과 30초 동안 와류에 넣습니다. DNA 결합 파라마그네틱 비드 50 μL과 100% 이소프로판올 400 μL을 넣고 실온(RT)에서 3분 동안 배양합니다. 튜브를 자기 랙에 2 분 동안 놓고 구슬을 방해하지 않도록주의하면서 상급기를 제거하십시오. DNA는 이 단계에서 자기 구슬에 결합됩니다. 세척 버퍼 1의 950 μL을 추가합니다. 30 초 동안 소용돌이 및 반복 단계 1.6. 1.7단계를 반복합니다. 세척 버퍼 2의 950 μL을 추가합니다. 30 초 동안 소용돌이 및 반복 단계 1.6. 용출 완충제와 소용돌이 100 μL을 2분 동안 추가합니다. 조혈 세포로부터 분리된 gDNA의 1 μL을 사용하여 260 nm, 280 nm 및 230 nm에서 OD를 획득하여 형광계를 사용하여 분광광도에 의해 gDNA의 순도를 측정하였다. 260및 280 nm의 광학 밀도(OD 비)의 비율이 1.7-2.0이고 260과 230 nm의 OD 비율이 1.5-2.4 사이인지 확인합니다. 2. 견본 준비 써모믹서를 56°C로 예열합니다. 모든 시료, 교정기 및 기준 재료에 대해 2mL 튜브에 라벨을 부착합니다. RT에서 용출 버퍼(1단계에 사용되는 키트와 함께 사용 가능)로 샘플 및 교정기와 교정기를 희석합니다. 모든 실험 샘플의 경우 gDNA를 총 부피 142 μL로 희석합니다. 예를 들어, 100 ng/μL에서 gDNA 4 μL을 용출 완충액 138 μL로 희석합니다.참고: 400-1,200 ng의 gDNA는 분석에 사용될 수 있다. 교정기의 75 μL을 총 부피 142 μL로 희석합니다. TE(pH = 8.0)를 공백으로 사용하여 분광광도계를 사용하여 기준 gDNA 농도를 확인합니다. 기준 gDNA의 1,000-1,200 ng를 총 부피 142 μL로 희석한다. 예를 들어, 100 ng/μL에서 기준 gDNA 10 μL을 용출 완충액 132 μL로 희석합니다. 열믹서에서 900 rpm에서 5분 동안 56°C에서 튜브를 배양합니다. 샘플을 수집하기 위해 튜브를 잠시 회전시다. 3. 비술핏 변환 참고: 비설핏 변환 중 의 배양 시간이 권장 시간을 따르도록 합니다. 과다 배양 또는 언더 배양은 분석의 결과에 영향을 미칠 것입니다. 써모믹서를 80°C로 설정합니다. 모든 튜브에 270 μL의 암모늄 비설핏과 90 μL의 테트라하이드로푸르퓨리엘 알코올(THFA)을 첨가합니다. 소용돌이는 완전히 혼합하고 짧게 바닥에 액체를 수집하기 위해 샘플을 회전. 900 rpm에서 45 분 동안 80 °C에서 열믹서에 튜브를 배양합니다. 열 블록을 사용하는 경우, 배양 동안 4.5 분마다 1-2 s의 튜브를 소용돌이. 샘플을 간단히 스핀다운하고 4단계 또는 5단계로 계속하기 전에 3-5분 동안 RT로 냉각시다. 최종 부피는 ~500 μL이어야 합니다. 4. CD8 및 트레그 어세이 비설핏 변환 후 DNA 정제참고: 이 단계는 비설핏 변환 DNA상에서 시판되는 DNA 정제 키트(재료 표참조)를 사용하여 수행됩니다. 사용하기 전에 시약이 RT로 데워져 있는지 확인하십시오. 정제를 시작하기 전에, 30s. 병에 열거된 부피를 따라 세척 완충액에 에탄올과 이소프로판올을 첨가하여 DNA 격리 파라마그네틱 비드의 균질혼합물을 만들고, 열 블록을 65°C로 설정한다. RT에서 3.4 단계에서 각 튜브에 870 μL의 용해 /결합 버퍼와 105 μL의 DNA 결합 파라마그네틱 비드를 추가하십시오. 소용돌이는 완전히 혼합하고 잠시 튜브를 회전합니다. 570 μL의 2-프로판올과 와류를 넣고 완전히 섞으세요. 온도 믹서 또는 표준 회전 믹서에서 50 rpm에서 7 분 동안 RT에서 튜브를 배양하십시오. 튜브를 간단히 회전시면 됩니다. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 5분 동안 배양합니다. 샘플을 마그네틱 랙에 계속 고정하면 구슬을 방해하지 않고 상급을 제거하십시오.참고 : DNA는 구슬에 바인딩됩니다. 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 900 μL의 세척 버퍼 1을 추가합니다. 튜브를 소용돌이로 하여 구슬을 완전히 다시 일시 중단한 다음 튜브를 잠시 회전시면 됩니다. 튜브를 마그네틱 랙으로 되돌리고 3분 동안 배양합니다. 샘플을 마그네틱 랙에 계속 고정하면 구슬을 방해하지 않고 상급을 제거하십시오. 세척(4.1.7-4.1.9)을 한 번 세척 버퍼 1로 반복한 다음 세척 버퍼 2로 두 번 반복합니다. 상급체를 제거한 후 튜브를 잠시 회전시키고 3분 동안 마그네틱 랙으로 돌아갑니다. 잔류 세척 버퍼 2를 모두 제거하고 마그네틱 랙에서 튜브를 제거합니다. 튜브 뚜껑을 65°C에서 15분 동안 열어 놓은 구슬을 건조시다. 각 튜브에 60 μL의 용출 버퍼를 추가하고 1,400 rpm에서 7 분 동안 RT에서 배양하십시오. 대안적으로, 폼 어댑터를 사용하여 적당한 속도로 와류를 사용한다. 튜브를 짧게 회전시키고 자기 랙에 2분 간 놓습니다. 55 μL의 용출을 구슬을 방해하지 않고 새로운 튜브로 옮김. 용리액은 비설핏 변환 DNA를 함유하고 있습니다. DNA 농도를 측정하는 것은 필요하지 않습니다. qPCR 설정 및 실행 qPCR 컴퓨터와 소프트웨어를 작동하는 컴퓨터를 켭니다. 소프트웨어 사용자 인터페이스에서 새 실험을 만들고 실험을 실행하는 데 사용되는 블록을 선택합니다. 표준 곡선을 실험 유형으로 선택합니다. 해당하는 경우 사용할 검출 화학을 선택합니다. 이 분석은 TaqMan 시약을사용합니다. 그렇지 않으면 ROX를 수동 참조로 선택합니다. 해당하는 경우 표준으로실행되는 계측기의 속성을 선택합니다. 대상(예: FAM을 리포터로 사용하는 GAPDH 또는 CD8)과 비형광 퀘이커를 할당하여 실험 설계를 정의합니다. 표준, 샘플 및 컨트롤에 대한 샘플 이름을 지정합니다. 다음으로, qPCR 플레이트에 따라 각 웰 포지션을 할당합니다. 각 웰은 CD8 또는 GAPDH와 같은 대상과 샘플 이름을 필요로 합니다. 각 샘플은 삼중으로 실행되며 계측기의 플레이트 레이아웃에 반영되어야 합니다. 각 표준을 작업 표준으로 지정하고 표 1에따라 최종 복사 번호를 지정합니다. 샘플, 교정기 할당 및 알 수 없음작업을 참조합니다. 템플릿 컨트롤이 없는 웰을 NTC 또는 N. 표준으로 사용할 람다 DNA(10 ng/μL)의 직렬 희석을 준비합니다(표 1참조). qPCR 마스터 믹스 칵테일을 준비, 대상 셀 유형에 대한 하나 와 GAPDH에 대한 하나 (표 2참조). 모든 샘플, 표준 및 NTC 제어를 세 배로 실행합니다.참고: GAPDH는 총 셀 수를 정량화하는 데 사용되며 대상 증폭과 병행하여 실행됩니다. CD8 B 유전자에 대한 미수정 조절 요소의 사본은 CD8 분석, Treg의 FoxP3 및 Th17의 IL-17에서 측정됩니다. qPCR에는 96웰 플레이트를 사용합니다. 먼저 우물에 템플릿 DNA의 3 μL을로드합니다. 다음으로, 마스터 믹스의 7 μL을 로드한다. qPCR 필름으로 플레이트를 밀봉하고 qPCR 계측기에 넣기 전에 플레이트를 잠시 회전시면 됩니다. 표 3과같이 qPCR을 실행합니다. 실행이 완료되면 qPCR 데이터를 .txt 또는 .xlsx 파일로 내보냅니다. CD8 분석및 Treg 분석(재료 표참조)에 대한 분석 템플릿을 사용하여 데이터를 분석하여 Ct 평균, Ct 표준 편차 및 복사 번호를 계산합니다. 초기 플라스미드 카피 수/3 μL 볼륨 희석제 DNA [1] 3 μL당 최종 복사 번호 레이블 31250 1000 μL – 31250 STD #1 31250 200 μL 800 μL 6250 STD #2 6250 200 μL 800 μL 1250 STD #3 1250 200 μL 800 μL 250 STD #4 250 200 μL 800 μL 50 STD#5 1250 30 μL 1200 μL 30 STD #6 [2] [1] TE에서 10 ng/μL 람다 DNA (10 mM 트리스, 1 mM EDTA, pH 8.0) [2] STD #3을 사용하여 STD#6을 준비합니다. 표 1: 표준 희석제의 준비. 31250-30 사본에 걸친 4 로그 희석 기준은 희석제로서 TE/람다 DNA를 사용하여 표에 따라 제조되었다. CD8 및 GAPDH 모두에 동일한 표준 희석이 사용되었습니다. 표준은 -20°C에서 보관하였다. 시약 금액 람다 DNA (TE에서 50 ng/μL, pH8.0) 1 μL 타크만 분석 0.5 μL 물, 뉴클레아제 프리 0.5 μL 마스터 믹스 5 μL 총 7 μL 표 2: qPCR 칵테일 의 준비. 테이블에 따른 템플릿 DNA를 제외한 CD8 및 GAPDH에 대해 각각 하나씩 두 개의 별도 튜브로 qPCR 마스터 믹스를 준비합니다. 단계 시간 임시 사이클 배양 전 약 35분 95°C 1X 증폭 15초 95°C 50배 1분 61°C 재사용 대기 시간 5초 42°C 1X 표 3: CD8 및 Treg 분석에 대한 qPCR 실행 파라미터. qPCR은 테이블에 지정된 매개 변수에 따라 실행되었습니다. 5. Th17 분석 비설핏 변환 후 DNA 정제 섹션 4.1에 설명된 대로 정제 단계를 수행합니다. 샘플을 용출하려면 각 튜브에 25 μL의 용출 버퍼를 추가하고 1,400 rpm에서 7 분 동안 RT에서 배양하십시오. 대안적으로, 폼 어댑터를 사용하여 적당한 속도로 와류를 사용한다. 튜브를 짧게 회전시키고 자기 랙에 2분 간 놓습니다. 20 μL의 용출을 구슬을 방해하지 않고 새로운 튜브로 옮김. 용리액은 비설핏 변환 DNA를 함유하고 있습니다. DNA 전암화참고 : DNA 전암화는 qPCR19를통해 정확한 정량화를 위해 낮은 풍부도 목표에 권장됩니다. Th17 메틸화 분석법은 이러한 이유로 전암화를 요구하도록 설계되었습니다. 비설핏 변환 DNA의 2 μL을 PCR 스트립 튜브로 옮김. 2 μL의 물로 NTC 튜브를 만듭니다. 모든 샘플에 대한 사전 증폭 마스터 믹스를 만듭니다(표 4참조). 각 튜브에 마스터 믹스 23 μL을 추가합니다. 튜브, 소용돌이를 캡하고 튜브를 잠시 회전시면 됩니다. 가열된 뚜껑을 사용하여 열자전거에서 프리앰프 프로토콜을 실행합니다. (표5). 달리기가 끝나면 튜브를 잠시 돌릴 수 있습니다. 증폭된 DNA의 2 μL을 새로운 튜브로 옮기고 78 μL의 물을 추가하여 샘플을 1:40으로 희석시냅니다. qPCR 설정 및 실행 섹션 4.2를 따라 qPCR을 설정하고 실행합니다. Th17 분석(재료 표 참조)에대한 분석 템플릿을 사용하여 데이터를 분석하여 Ct 평균, Ct 표준 편차 및 복사 번호를 계산합니다. 시약 금액 물, 뉴클레아제 프리 9.5 μL 핫 스타트 PCR 마스터 믹스 12.5 μL Th17 PCR 프라이머 1 μL 총 23 μL 표 4: Th17 분석에 대한 DNA를 미리 증폭한다. 사전 증폭 반응 마스터 믹스를 테이블에 따라 제조하였다. 단계 시간 임시 사이클 배양 전 약 35분 95°C 1X 변성 1분 95°C 12배 어 닐 링 45초 55°C 신장 30초 72°C 최종 신장 약 10분 72°C 1X 개최 무기한 4°C 표 5: Th17 DNA를 프리앰프. Th17 DNA는 실제 qPCR 전에 12사이클 동안 미리 증폭되었다.