يتم تقديم بروتوكول لتركيب أوليغوس اتبرويد مشفرة بالمعلومات وللتجميع الذاتي الموجه للتسلسل من هذه الببيدويدات في سلالم جزيئية باستخدام الأمينات والألدهيدات كأزواج ديناميكية متفاعلة التكافؤ ولويس الحمضية النادرة الأرض المضخات المعدنية ككواشف متعددة الأدوار.
يعرض هذا البروتوكول استخدام الكواشف متعددة الأدوار الحمضية لويس للتحايل على الملائمة الحركية التي لوحظت أثناء التجميع الذاتي لخيوط القلة المشفرة بالمعلومات بوساطة تفاعلات ديناميكية زوجية مقترنة بطريقة تحاكي الدراجات الحرارية المستخدمة عادة للتجميع الذاتي لتسلسلات الحمض النووي النووي التكميلي. يتم استخدام مونومرات الأمين الأولية التي تحمل ألدهيد وثنائيات قلادة الأمين مع مجموعات الحماية المتعامدة لاستخدامها كأزواج ديناميكية متفاعلة التكافؤ. باستخدام مركب الببتيد الآلي المعدل ، يتم ترميز مونومرات الأمين الأولية في خيوط oligo (peptoid) من خلال تخليق تحت يلومير في المرحلة الصلبة. عند التنقية بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) والتوصيف بواسطة قياس الطيف الكتلي التأين يُتأين بالكهرباء (ESI-MS)، يتم إخضاع القلة المحددة للتسلسل إلى تحميل عالي من ثلاثية معدنية حمضية من Lewis الحمضية والتي تقوم على حد سواء بإزالة الحماية من الـ alde moihyde وتؤثر على توازن الزوج المعتفي بحيث تنفصل الخيوط تمامًا. وفي وقت لاحق، يتم استخراج جزء صغير من حمض لويس، مما يتيح تحديد خيوط تكميلية خاصة بالتسلسل لتشكيل سلالم جزيئية مشفرة بالمعلومات تتميز بمصفوفة بمساعدة قياس الطيف الكتلي بالليزر المسيبة/التأينية (MALDI-MS). يتحايل الإجراء البسيط المبين في هذا التقرير على الفخاخ الحركية التي يتم تجربتها عادة في مجال التجميع المنافلي الديناميكي ويعمل كمنصة للتصميم المستقبلي للبنيات القوية والمعقدة.
وقد أتاح التقدم المحرز في التجميع الذاتي، وهي العملية التي تولد بها الوحدات الفرعية الصغيرة أبنية أكبر من خلال مسارات تحركها الدينامية الحرارية، تحكماً أفضل في الهياكل النانوية الكلية وفوق الجزيئية عادة عن طريق استغلال التفاعلات بين الجزيئات مثل التراص ورابطةالهيدروجين1و2و3و4. على وجه الخصوص ، ظهرت الأحماض النووية (أي المتعددة النيوكليوتيدات) كوسائط نانو بناء متعددة بشكل ملحوظ حيث أن كثافة المعلومات العالية التي يوفرها اقتران قاعدة Watson-Crick تسمح بتجميع الهياكل المعقدة الانتقائية للتسلسل4،5. في حين أن القوة المنخفضة بطبيعتها لهذه الروابط العابرة بين الجزيئيات تمكن من إعادة ترتيب الوحدة الفرعية وتصحيح الأخطاء ، فإن الهياكل الناتجة غالبًا ما تكون عرضة للتدهور الحراري والميكانيكي6. في المقابل، تفاعلات حيوية التكافؤ7،8،9، فئة من ردود الفعل القابلة للتهيئة السندات المندرجة التي يمكن عكسها أو إعادة ترتيبها في ظل ظروف خفيفة وقد تم توظيفها مؤخرًا لإنتاج جزيئات معقدة مثل سلالم10،11،12،13، أقفاص14،15،16، وأكوام17، تقدم زيادة قوة السندات والهياكل القوية. ومما يؤسف له أن القدرة على إعادة الترتيب والتحقق من الأخطاء تتضاءل بسبب الانخفاض النسبي في معدلات إعادة ترتيب هذه الأنواع المندمجة، مما يحد من قدرتها على التجميع الذاتي إلى منتجات مرغوبفيها18. لمعالجة هذا الملائمة الحركية ، غالبًا ما يتم استخدام المحفزات أو ظروف رد الفعل القاسية جنبًا إلى جنب مع اللبنات الأساسية البسيطة. هنا، نبلغ عن عملية تتحايل على الملائمة الحركية لتمكين التجميع الذاتي للسلالم الجزيئية من القلة الخاصة بالتسلسل حيث يتم توجيه التهجين بواسطة المعلومات المشفرة في تسلسل بقايا القلة.
وبالنظر إلى إمكانية الوصول الاصطناعية، يتم استخدام البولي (N-alternativeed glycine) (أي الببتيدات) كسلائف oligomeric التي يتم تجميع السلالم الجزيئية منها19. البببيدوتيدات هي ايزومرات هيكلية من الببتيدات التي يتم فيها لصق مجموعات القلادة على النيتروجين الذي يحمله العمود الفقري بدلاً من أن تقترن بالكربون α20. باستخدام تخليق المرحلة الصلبة ، يتم بسهولة تحقيق التنسيب الدقيق لمجموعات القلادة العضوية الديناميكية على طول سلسلة البذبويد ، مما يسمح بتصميم oligomers السلائف التي يمكن أن تتجمع في هياكل فوق جزيئية معقدة21.
يتم استخدام إعادة ترتيب المنصهر الديناميكي للاتصال imine في هذا الإجراء حيث يوفر تفاعل التكثيف المولد للأيمن وسيلة مريحة لتوصيف التجميع الذاتي عن طريق قياس الطيف الكتلي حيث أن كل سند يشكل نتائج في انخفاض كتلة 18 جم/مول22. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تختلف التوازن بين الأمين والمواد المتفاعلة ألدهيد والمنتج ايمين عن طريق تغيير تركيز حمض. على وجه التحديد، وتستخدم ثلاثيات المعادن الأرضية النادرة للتأثير على التوازن، وبالإضافة إلى ذلك إزالة حماية الألديهيد الألدهيدات الأسيتال المحمية من الإيثيلين23،24،25. تجدر الإشارة إلى أن تريفلات السكانديوم يستخدم بالفعل بشكل شائع في مجال التجميع الذاتي المنقافي الديناميكي ، بما في ذلك نجاحه الأخير في المساعدة على تركيب الأطر العضوية العضوية العضوية العضوية (COFs) في درجة حرارة الغرفة26،27. بالإضافة إلى ذلك، فإن الذوبان المتناقض لتسلسل اتّهات القلة (الببتيد) وتريفلات المعادن الأرضية النادرة يمكّن من التحكم في التوازن من خلال استخراج السائل السائل. وتستخدم العملية المبلغ عنها هذه السيطرة للتحايل على الحواجز الحركية التي تحول دون التجميع الذاتي الموجه للمعلومات.
وتصف التقنية الواردة هنا التجميع الدينامي المنصهر للأوليغوسات الببتيدية الحاملة للمعلومات، حيث يتم ترميز المعلومات في تسلسل مجموعات القلادة الخاصة بهم. استخدام مونومر أمين محمي Alloc بالتزامن مع مونومر ألدهيد المحمية من الأسيتال الإيثيلين يسمح بإزالة الحماية المتعامدة ، مما يتيح إزالة الحماية من Alloc على الخرز وإزالة الحماية من الأسيتال في الموقع أثناء رد فعل التجميع الذاتي ، وبالتالي ضمان عدم تفاعل التسلسلات المركبة قبل الأوان قبل تنقية القلة وتوصيفها. الأهم من ذلك، يتم تنفيذ التوليف الصلبة المرحلة باستخدام راتنج photolabile لتمكين انشقاق أوليغومر من عصير تحت الأشعة فوق البنفسجية أو تشعيع الضوء البنفسجي، مما يمنع إزالة الحماية المبكرة من حمض-labile، الاسيتال الاثيلين القائم على مجموعة الحماية. ويمكن النظر في عدة مخططات بديلة لإزالة الحماية. على سبيل المثال، قمنا في البداية بتوظيف مجموعات حماية مزدوجة للحمض-لابيل (Boc-amine والأسيتا-ألدهيد الإيثيلين) بنية إزالة الحماية في الموقع بواسطة حمض قوي يتبعه تحييد للسماح لرد فعل التجميع الذاتي بالمضي قدمًا؛ ومع ذلك ، أدى هذا النهج في التوليد الفوري للتعجيل عند إضافة قاعدة. بدلا من ذلك، كان من المتوخى حماية الأمين مع مجموعة حماية photolabile، 2-(2-النيتروفينيل) بروبوكسيكاربونيل (NPPOC)، كما يمكن إزالة الألدهيد انتقائيا عند العلاج مع حمض ثلاثي فلوريوأواسيتيك (TFA) قبل التنقية. لسوء الحظ ، في التحليل الضوئي في الموقع لمجموعة الحماية مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لم تتحمل إزالة الحماية الكمية ، حتى في وجود الحساسية الضوئية وبعد فترات إشعاع طويلة25. يمكن استخدام ثلاثي ميثيل الليميثوكسيكاربوكربونيل (أي تيوك) كمجموعة تحمي الأمين ويخضع للانشقاق عند العلاج بثلاثيات المعادن الأرضية النادرة؛ ومع ذلك ، يتطلب إزالة الحماية الكمية Teoc أعلى بكثير من تحميل المعادن النادرة من ذلك الضروري لإزالة الحماية من الإيثيلين الأسيتال. لهذا البروتوكول، يمكن استخدام تيوك-الأمينات، ولكن يجب تعديل تركيز حمض لويس وفقا لذلك كما إزالة الأمين دون الكمية يمكن أن تكون إشكالية لهياكل أكبر تجميعها ذاتيا. تم النظر في مجموعات وظيفية Aliphatic لفترة وجيزة ، ولكن إزالة الحماية من ألدهيدات الأفاتيك يتطلب ظروفًا قاسية تُقطع تسلسلات الببتيد32،33.
إن إدراج الني وNma كمخلفات فاصلة خاملة يعمل على تحسين ذوبان القلة وتمكين وضع علامات كتلة سهلة على القلة السليفة لتحمل التعرف الجاهز على الأنواع المتولدة عن طريق التحليل الطيفي الشامل. وعلاوة على ذلك، نظرا ً للتشكيل “التوليفي” من الببذبوتيدات حيث تعتمد الأجزاء الأساسية المجاورة حالات دورانية معارضة لتشكيل أوليغومر خطي خالٍ من التقلبات34،35، فإن التسلسلات التي تتضمن بقايا فاصلة ديناميكية متناوبة وخاملة تسهل بنية يتم فيها توجيه مجموعات القلادة التفاعلية في نفس الاتجاه. وبالنظر إلى براعة طريقة submonomer ، يمكن استخدام مكتبة كبيرة ومتنوعة من الأمينات الأولية لزيادة تعديل oligomers peptoid ولكن قد تتطلب تعديلات على البروتوكول للحفاظ على كفاءة اقتران عالية.
في حين أن oligo (peptoids) يمكن توليفها يدويا في وعاء تفاعل الزجاج19، أتمتة العملية يقلل من الوقت لكل بقايا إضافة من عدة ساعات إلى نصف ساعة. بالإضافة إلى ذلك، تقلل الأتمتة من كمية المونومر وغسل النفايات المذيبة، وهو أمر مرغوب فيه بشكل خاص عند استخدام مونومرات الأمين الأولية غير المتاحة تجاريًا. على الرغم من أن انشقاق Alloc من بقايا الأمين المحمي هو رد فعل فعال ، يمكن أن يؤدي أكسدة البلاديوم إلى إزالة الحماية غير الكاملة. وبالتالي، يقترح اختبار الرمق جزء من الراتنج وتوصيف مدى إزالة الحماية مع ESI-MS. لاختبار الانقسامات، 30 دقيقة تحت 405 نانومتر النشرات التشعيع كافية لقياس الطيف الكتلي. يمكن أن يقتصر الحماية الجزئية مع استخدام الظروف اللاهوائية أو تكرار رد فعل إزالة الحماية.
في حين أن هذه المقالة تركز على Sc (OTf)3 ككاشف متعدد الأدوار ، فقد ثبت أن الألواح المعدنية النادرة الأخرى ، مثل ytterbium triflate ، تتوسط بنجاح في تجميع سلالم الجزيئية الموجه للمعلومات. وتجدر الإشارة إلى أن Sc (OTf)3 هو أكثر حمضية لويس من الترايثات المعدنية النادرة الأرضية. وبالتالي ، نظرا لانخفاض القدرة الحفازة التي تتيحها غيرها من triflates المعادن النادرة الأرض24،36، قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من المعادلات لتنفيذ إزالة الإيثيلين اسيتال كاملة والتفكك حبلا. ويمكن تحديد عدد المعادلات المطلوبة باستخدام قياس الطيف الكتلي MALDI عن طريق ملاحظة نقطة تنفصل فيها الخيوط تماماً. الانفصام أمر بالغ الأهمية في عملية التجميع الذاتي ويماثل ذوبان خيوط الحمض النووي في درجة حرارة مرتفعة. يتيح الاستخراج اللاحق للمحفز تكوين وتعطيل الاقترانات المزدوجة الديناميكية التي تدفع تجميع الدوبلبلات الخاصة بالتسلسل. هذا الصلب التدريجي من خيوط oligomeric يتحايل على الملائمة الحركية (التي، بالنسبة للسلالم الجزيئية، يمكن أن تسفر عن الأنواع خارج التسجيل أو تسلسل الزوج بشكل غير صحيح) التي تعاني منها أساليب أخرى.
الكلوروفورم هو مذيب ممتاز كفصل مرحلة في نظام الكلوروفورم / الأسيتونتريل / المياه الثلاثية المستخدمة هنا يعزز الاستخراج الجزئي لحمض لويس دون أن يؤدي إلى هطول الأمطار من الهياكل ذاتية التجميع37. بالإضافة إلى ذلك، الكلوروفورم هو واحد من المذيبات القليلة التي تعزز تكوين الإامين مع الحفاظ على ذوبان السلم الجزيئي. ويمكن في كثير من الأحيان ملاحظة كميات ضئيلة من الدوبلز خارج السجل والدوبلز المقترنة بشكل غير صحيح بسبب الطبيعة الدينامية للنظام. وعلى الرغم من أن هذا النظام لا يتأثر إلى حد كبير بالتباين الصغير في تركيزات المعادن الأرضية النادرة عند الاستخراج، فإن عدم كفاية استخراج المحفزات يولد في بعض الأحيان جزءاً كبيراً من التهجين غير الكامل ووصلات القلة غير المحددة. في هذه الحالة ، من الأفضل بشكل عام إعادة الإنفصال أولاً بمكافئات إضافية 1.5 من المحفز ثم استخراج مرة ثانية بدلاً من إعادة استخراجها على الفور ، حيث أن الانفصال الكامل للخيوط المفردة أمر حيوي للعملية. لتجميع عدة سلالم جزيئية فريدة من نوعها مشفرة بالمعلومات في وقت واحد ، قد يكون من الضروري زيادة تركيز محلول مخزون triflate المعدن النادر الأرض المستخدم للحفاظ على مكافئات وحجم التفاعل الكلي.
في حين أن هذه التجميعات الذاتية تتميز في المقام الأول بالقياس الطيفي الكتلي ، فإن التقنيات الأخرى بما في ذلك نقل الطاقة بالرنين الفلوري (FRET) ممكنة. وتشمل القيود كمية المواد اللازمة، والقدرة على تحمل تكاليف المونومرات، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء. التقنيات التي تتطلب المذيبات، مثل 1H NMR، يمكن أن تعاني بالإضافة إلى ذلك من عدم قابلية الذوبان من الهياكل التي تم تجميعها ذاتيا. وعلاوة على ذلك، يمكن تحديد تركيزات المعادن النادرة بعد الاستخراج من خلال أساليب مثل ICP-MS أو 19NMR مع معيار داخلي.
ومع تقدم التقدم نحو تحسين السيطرة على الهياكل النانوية والمواد الكلية وفوق الجزيئية، ينشأ التحدي المتمثل في تصميم وتلفيق التجميعات العادية، ولكن القابلة للتعديل. ويوفر البروتوكول الموصوف في هذا التقرير مساراً لتحقيق هذه الهياكل النانوية من خلال التجميعات الانتقائية التسلسلية عن طريق التفاعلات العضوية الدينامية.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الطاقة الأميركية، ومكتب العلوم، وعلوم الطاقة الأساسية، تحت جائزة #DESC0012479. تُقر شركة S.C.L. بدعم من برنامج زمالة أبحاث الدراسات العليا التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم، وتعترف شركة أبوظبي للعلوم بالدعم المقدم من شركة بترول أبوظبي الوطنية (أدنوك).
1,4-Dioxane | Fisher Scientific | D1114 | Certified ACS |
2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid (HABA) | Millipore-Sigma | 54793 | Matrix substance for MALDI-MS; ≥99.5% |
4-(2-Aminoethyl)aniline | Ontario Chemicals | A2076 | 98% |
4-Cyanobenzaldehyde | Oakwood Chemical | 049317 | 99% |
4-Methylpiperidine | TCI America | P0445 | ≥98.0% |
4-Toluenesulfonyl chloride | Oakwood Chemical | BR1703 | 99% |
50 mL High Performance Centrifuge Tubes | VWR International | 21008-240 | Centrifuge Tubes used for automated synthesizer |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | Glacial |
Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10 | Certified ACS |
Acetonitrile | Millipore-Sigma | 34851 | For HPLC; Gradient grade; ≥99.9% |
All-plastic Norm-Ject syringes | Thermo Fisher Scientific | S7510-10 | Luer-Slip Syringe |
Allyl chloroformate | Acros Organics | 221741000 | 97% |
Bromoacetic acid | Alfa Aesar | A14403 | ≥98.0% |
Chloroform | Millipore-Sigma | 288306 | Anhydrous; ≥99%; Contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
Chloroform-d | Acros Organics | AC320690075 | For NMR; 99.8 atom % D; Packaged in 0.75 ml ampoules |
Dichlorodimethylsilane | Acros Organics | 1133100 | ≥99.0% |
Dichloroethane | Fisher Scientific | E175 | Certified ACS |
Dichloromethane | Fisher Scientific | D37-4 | Stabalized; Certified ACS |
Diethyl ether | Acros Organics | 615080010 | Anhydrous; ACS reagent |
Diethylene glycol monoethyl ether | TCI America | E0048 | ≥99.0% |
Ethanol | Decon Labs | 2701 | 200 Proof; Anhydrous |
Ethylene glycol | Fisher Scientific | E178 | Certified |
Fmoc-Photolabile SS resin | CreoSalus | SA50785 | 100-200 mesh; 1% DVB |
Glass Peptide Vessel | Chemglass | CG-1866-02 | Solid Phase, T-Bore PTFE Stpk, Vacuum, Medium Frit, GL 25 Thread |
LC-6AD HPLC pumps | Shimadzu Corporation | Equipment | |
LED 405nm | ThorLabs | M405L2-C1 | 405 nm LED used for photocleavage of peptoid |
LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | Driver for LED light used in photocleavage of peptoid |
Liberty Blue Automated Peptide Synthesizer | CEM Corporation | Equipment | |
Lithium aluminum hydride | Millipore-Sigma | 199877 | Powder; Reagent grade; 95%; CAUTION: Mildly pyrophoric, handle under inert gas and protect from moisture |
Luna C18 analytical RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4252-E0 | Equipment |
Luna C18 prepatory RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4253-P0-AX | Equipment |
Methanol | Fisher Scientific | A412 | Certified ACS |
Microliter Syringe | Hamilton Company | 80700 | Cemented Needle (N) |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) | Oakwood Chemical | M02889 | ≥99.0%; CAUTION: DIC is hazardous to eyes, skin, via respiratory inhalation, and may cause skin sensitization |
N,N-Dimethylformamide | Millipore-Sigma | 319937 | ACS reagent; ≥99.8% |
Nitric acid | Fisher Scientific | A200-212 | Certified ACS Plus |
Nitrogen gas | Cryogenic Gases | Contents under pressure, may explode if heated | |
Phenylsilane | Oakwood Chemical | S13600 | 97% |
Prominence SPD-10A UV/vis Detector | Shimadzu Corporation | Equipment | |
p-Toluenesulfonic acid monohydrate | Millipore-Sigma | 402885 | ACS reagent; ≥98.5% |
Scandium(III) triflate | Oakwood Chemical | 009343 | 99% |
Single-use Needle | Exel International | 26420 | 18G x 1 1/2″ |
Sodium azide | Oakwood Chemical | 094448 | 99%; CAUTION: NaN3 may react with lead and copper which results in the formation of highly explosive metal azides. It is acutely toxic and fatal if swallowed or in contact with skin. |
Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | Powder; Certified ACS |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Pellets; Certified ACS |
Sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | Anhydrous; Granular; Certified ACS |
Syringe Filter 0.45 µm | VWR International | 28145-497 | PTFE, Syringe Filters with Polypropylene Housing |
Tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T397 | Certified |
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium(0) | Oakwood Chemical | 034279 | 98% |
Toluene | Fisher Scientific | T324 | Certified ACS |
Triphenylphosphine | Oakwood Chemical | 037818 | 99% |