Subcellulaire fractionering van primaire chronische lymfatische leukemie cellen om te controleren van nucleaire/cytoplasmatische eiwit handel

Het gebruik van primaire monsters van CLL-patiënten die hier worden beschreven, is goedgekeurd door het westen van Schotland Research Ethics service, NHS Greater Glasgow en Clyde (UK) en alle werkzaamheden werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen. 1. isolatie van CLL-cellen uit bloedmonsters van patiënten Perifere bloedmonsters van eerder toegestemde CLL-patiënten worden ontvangen van de kliniek in EDTA-bloedopvangbuisjes, begeleid door het witte celgetal (WCC). Zuivert de perifere bloed CLL-monsters volgens de WCC. Voor WCC < 40 x 106 cellen/ml, ga verder naar stap 1.1.1; voor WCC ≥ 40 x 106 cellen/ml, ga verder naar stap 1.1.2. Giet de inhoud van alle EDTA-bloedbuizen in een conische centrifugebuis van 50 mL en voeg 50 μL humane B-Celverrijkings cocktail toe per 1 mL bloed. Incuberen bij kamertemperatuur (RT) gedurende 20 min. Ga verder naar stap 1.1.2. Verdun het monster met een verhouding van 1:1 met RT CLL-reinigings buffer (fosfaatgebufferde Salin (PBS), 0,5% foetaal serum (FBS) en 2 mM EDTA). Met een dichtheidsgradiënt van ALIQUOT in een conische centrifugebuis van het monster (10 mL in een buis van 50 mL voor 30 mL monster of 4 mL in een buis van 15 mL voor 10 mL monster). Laag het monster voorzichtig bovenop de dichtheidsgradiënt media en centrifugeer bij 400 x g gedurende 30 minuten bij RT.Opmerking: Zorg ervoor dat de centrifuge op RT staat voordat de monsters in de centrifuge worden geplaatst, aangezien een verandering in temperatuur resulteert in een slechte verrijking van mononucleaire cellen en de rem op de centrifuge uitschakelt, omdat plotseling remmen de vloeistof interface kan verstoren. Oogst voorzichtig de witte laag mononucleaire cellen die op het raakvlak van de dichtheidsgradiënt media en de CLL-reinigings buffer worden verzameld, in een nieuwe conische centrifugebuis van 50 mL met behulp van een kunststof Pasteur-pipet. Voeg 40 mL CLL-reinigings buffer toe aan de geïsoleerde monolaag om de cellen te wassen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij RT. Gooi het supernatant weg, regeer de pellet door de bodem van de buis te flikken en herhaal vervolgens de wasstap die wordt beschreven in stap 1,5. Gooi het supernatant weg, regeer de pellet zoals beschreven in stap 1,6, en breng de pellet in een vast volume CLL-wasbuffer (tot 40 mL, afhankelijk van de grootte van de celpellet). Tel de cellen met trypan Blue en een hemocytometer. Ga vervolgens naar flow flowcytometrieonderzoeken om de zuiverheid van CLL cellen te controleren.Opmerking: In dit stadium kunnen de CLL-cellen worden gekweekt in een concentratie van 10 x 106 cellen/ml in media om te worden gebruikt in experimenten, en/of cryopreserved in 10% dimethylsulfoxide (DMSO)/FBS voor toekomstig werk bij concentraties van maximaal 100 x 106 cellen/injectieflacon. 2. Flowcytometrie van CLL-cellen Etiket 12 mm x 75 mm ronde bodem polystyreen buizen zoals beschreven in tabel 1. In tubes 2 – 5, zet een druppel compensatie kralen en bewaar op ijs. Voeg 1 μL van het geschikte antilichaam (anti-CD5, CD19, CD23 of CD45, zoals aangegeven in tabel 1) toe aan buisjes 2 – 5, en incuberen op ijs gedurende 20 minuten, beschermd tegen licht door het aanbrengen van tin folie over de ijsemmer.Opmerking: Deze buizen fungeren als compensatie controles voor het instellen van de flow flowcytometrieonderzoeken sjabloon. Zet tot 1 x 106 CLL-cellen in buizen 1, 6 en 7, voeg 2 ml FACS buffer (PBS + 2% FBS) toe aan elke buis en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT om de cellen te wassen. Gooi het supernatant weg en bewaar de buisjes met celpellets op ijs. Respendeer de celpellets en voeg de juiste combinatie van antilichamen toe aan de cellen in buis 7 volgens de instructies in tabel 1, in een eindvolume van 100 ΜL met FACS buffer. Antilichamen worden gebruikt in een geschikte concentratie volgens de richtlijnen van de fabrikant. Respendeer de celpellets in buisjes 2 en 6 in 100 μL FACS buffer. Inbroed de cellen op ijs, naast de gekleurde kralen in buisjes 2 – 5, beschermd tegen licht gedurende 20 minuten. Na de incubatie, voeg 2 mL FACS buffer toe aan alle buisjes en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT om de cellen te wassen. Gooi de supernatant weg en regeer de kraal/celpellets door zachtjes de buisjes te flikken. Respendeer buizen 1-5 in 100 μL FACS buffer en plaats op ijs tot klaar om te analyseren op de flow cytometer. Verdun de DAPI-oplossing onmiddellijk vóór gebruik tot 0,05-0,2 μg/mL in de FACS-buffer. De optimale concentratie kan variëren en titratie wordt aanbevolen. Respendeer buizen 6 en 7 met 100 μL verdunde DAPI-oplossing en inincuberen de buisjes op ijs gedurende minimaal 5 minuten om de cellen te laten vlekken.Opmerking: Verder wassen is niet nodig omdat DAPI aanwezig moet zijn in de buffer van dode cellen om geëtiketteerd te blijven. Zodra DAPI is toegevoegd, moeten cellen worden geanalyseerd op de flow-cytometer binnen 4 uur. Analyseer cellen met behulp van een flow cytometer. 3. bereiding van Subcellulaire fracties uit CLL-cellen Opmerking: Bij het plannen van de experimentele opstelling, omvatten een goed van niet-gestimuleerde/onbehandelde cellen waaruit het hele celextract kan worden gegenereerd. Voer de gewenste stimulatie en/of medicamenteuze behandeling van de MEC1 CLL-cellijn of geïsoleerde primaire CLL-cellen uit met 10 – 20 x 106 cellen/conditie. Cellen worden vervolgens gebruikt voor subcellulaire fractionering (stappen 3,4 & 3,5) of voor het genereren van hele celextract (stap 3,6). Bereiding van de oplossingen/buizen: Bereid alle oplossingen/buffers vers op de dag van de fractionering, voordat de cellen worden geoogst. Bewaar de oplossingen op ijs tot het nodig is en gebruik deze binnen 4 uur na bereiding. PBS/fosfatase inhibitor oplossing: bereid de fosfatase remmers in PBS door verdunning van de fosfatase remmers 1:20 in 1x PBS (d.w.z. 0,5 mL fosfatase remmers in 9,5 mL 1x PBS).Opmerking: Zorg ervoor dat de fosfatase remmers niet zijn neergeprecipiteerd. Als er een neerslag aanwezig is, verhit tot 50 °C gedurende 10 min. Hypotone buffer: bereid 1x hypotone buffer door het maken van een 1:10 verdunning van 10x hypotone buffer in gedistilleerd water (d.w.z. 50 μL van 10x hypotone buffer in 450 μ L van dH2O). 10 mm dithiotreïtol (DTT): bereid 10 mm DTT voor door een 1:100 verdunning van 1M DTT te maken met gedestilleerd water (d.w.z. 10 μL van 1 M DTT in 990 μL DH2O).Opmerking: DTT is zeer labiele dus bereid dit vers elke keer. Vermijd herhaalde Vries/ontdooien cycli. Volledige lysisbuffer: Bepaal hoeveel buffer vereist is voor elk experiment. Voor elk monster is 50 μL volledige lysisbuffer nodig, dus voeg 5 μL 10 mM DTT (stap 3.2.3) toe aan 44,5 μL lysisbuffer en voeg vervolgens 0,5 μL proteaseremmer-cocktail toe. Dit bedrag kan worden opgeschaald, afhankelijk van het aantal monsters in het experiment. Label vier sets van 1,5 mL microfugebuis buizen voor elke stimulatie en/of medicamenteuze behandeling voor de vers gestimuleerde cellen (stap 3,3), de vers gegenereerde cytoplasmische fracties (stap 3.4.3), de vers gegenereerde kern fracties (stap 3.5.3), en de hele cel eiwitlysaten (stap 3.6.3). Pre-chill deze microfugebuis tubes op ijs tot het nodig is. Breng de cellen over in individueel gelabelde 1,5 mL microfugebuis buisjes en pellet door centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Verwijder de supernatant en rebreng de cellen in 1 mL ijskoude PBS/fosfatase remmers (stap 3.2.1). Pellet de cellen door centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Verwijder de supernatant en houd de celpellets op ijs. Bereiding van cytoplasmische fracties: Breng de celpellets voorzichtig over om te worden gebruikt voor subcellulaire fractionering in 50 μL van 1x hypotone buffer (stap 3.2.2). Incuberen de cellen op ijs gedurende 15 minuten om de cellen te laten zwellen.Opmerking: Het volume van de gebruikte hypotone buffer kan empirisch worden verhoogd, afhankelijk van het celnummer. Voeg 0,8-2,5 μL (1:20 tot 1:60) afwasmiddel toe aan elk monster en Vortex op de hoogste instelling voor 10 sec. Om te bepalen van de optimale concentratie van detergens te gebruiken voor een specifiek celtype te isoleren van nucleaire en cytoplasmorische fracties, voer een wasmiddel gradiënt in eerste instantie. Een bereik van 1:20 tot 1:60 (d.w.z. 2,5 μL tot 0,8 μL afwasmiddel in 50 μL hypotone buffer) moet toereikend zijn.Opmerking: als het volume van de hypotone buffer in stap 3,4 wordt aangepast, zorg dan dat de juiste reinigings verhouding gehandhaafd blijft. Verifieer cellysis door cellen te observeren met behulp van een fasecontrastmicroscoop voor en na toevoeging van wasmiddel. Hele cellen lijken groter met een dichte, donkere kern. Het cytoplasma zal verschijnen als een heldere Halo rond de Nucleus.Opmerking: Geschikte lysis wordt verder bevestigd door het gebruik van Western blotting om specifieke eiwitten te analyseren binnen de gelyseerd fracties gegenereerd uit het wasmiddel gradiënt. Centrifugeer na het lysed de monsters bij 14.000 x g gedurende 30 sec. bij 4 °c. Breng het supernatant voorzichtig over in een voorgekoeld, gelabeld microfugebuis buisje. Deze cytoplasmische fractie kan worden opgeslagen bij-80 °c totdat nodig voor verdere analyse. De overblijvende pellet bevat de nucleaire fractie (stap 3,5).Opmerking: Vermijd herhaalde vries/dooi cycli van de monsters. Bereiding van kern fracties: Respendeer elke nucleaire pellet in 50 μL complete lysisbuffer (stap 3.2.4) door op en neer te pipetteren.Opmerking: Het volume van de volledige lysisbuffer kan empirisch worden aangepast volgens het startcel nummer. Voeg 2,5 μL afwasmiddel toe om eiwitten die zijn geassocieerd met het nucleaire membraan en de Vortex op de hoogste instelling voor 10 s te solubiliseren. Incubeer de monsters op ijs gedurende 30 minuten. Vortex op de hoogste stand voor 30 s, vervolgens Centrifugeer de monsters bij 14.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °c. Breng het supernatant over in een voorgekoeld, gelabeld microfugebuis buisje. Deze nucleaire fractie kan worden opgeslagen bij-80 °c tot het nodig is voor verdere analyse.Opmerking: Vermijd herhaalde vries/dooi cycli van de monsters. Bereiding van hele cellysaten (WCL) uit CLL-cellenOpmerking: De bereiding van het hele celextract kan tegelijkertijd met de bereiding van de nucleaire fracties worden uitgevoerd (stap 3,5). Breng de volledige celextract pellets in 100 μL complete lysisbuffer (bereid in stap 3.2.4) door met pipetteren op en neer, voeg vervolgens 5 μL afwasmiddel toe om volledige cellyse te garanderen. Incuberen de monsters op ijs gedurende 30 minuten. Vortex op de hoogste stand voor 30 s, vervolgens Centrifugeer de monsters bij 14.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °c. Breng het supernatant over in een voorgekoeld microfugebuis buisje. Dit hele celllysaat kan worden bewaard bij-80 °c tot het nodig is voor verdere analyse.Opmerking: Vermijd herhaalde vries/dooi cycli van de monsters. 4. downstreamanalyse van Subcellulaire fracties Opmerking: In dit protocol werd analyse van de gegenereerde celfracties uitgevoerd door Western blotting met behulp van standaardprotocollen, het laden van gelijke celaantallen/rijstrook (equivalent aan ~ 10 μg eiwit) voor nucleaire en cytoplasmorische fracties. Kwantificering van de eiwit handel tussen nucleaire en cytoplasmische fracties: Voer kwantitatieve analyse van westerse Blot uit door kwantatie van de signaalintensiteit of densitometrie met behulp van vrij beschikbare Western Blot-analyse software. Afbeeldingen importeren: Afbeeldingen van Western Blot die zijn gegenereerd op basis van verschillende ontwikkelingsinstrumenten, moeten worden geïmporteerd als JPG-, PNG-of TIFF-bestanden. Een 16-bits diepte-RAW-bestand wordt aanbevolen. Als u een afbeelding wilt importeren, klikt u op het pictogram Software en plaatst u de muisaanwijzer op importeren. Klik vervolgens op afbeeldingen van derden. Selecteer het afbeeldingsbestand en klik op openen. De afbeelding wordt weergegeven: Klik in het lint afbeelding op de knop kiezen in de groep weergeven . Het dialoogvenster weergave aanpassen wordt geopend om indien nodig verdere aanpassingen mogelijk te maken. Implementeer extra verbeteringen, waaronder helderheid of contrast met behulp van de instelbare schuifregelaars op het tabblad afbeelding Luts . gebruik het tabblad curven voor fijnere aanpassingen. Gegevensanalyse (kanaal deselectie): Klik op het lint analyse. Als u slechts één kanaal wilt analyseren, deselecteert u de kanaal (en) die niet worden geanalyseerd. Klik op de miniatuur van een kanaal niet tonen in de afbeelding LUTs, waardoor alleen het gewenste kanaal wordt weergegeven. Voor afbeeldingen die zijn geïmporteerd als JPG-, PNG-of TIFF-bestanden kan een selectie van meerdere ongewenste RGB-kanalen nodig zijn. Vormen toevoegen: Als u de signaalintensiteit wilt kwantificeren, klikt u op rechthoek toevoegen om een rechthoek aan de afbeelding toe te voegen. Klik op het midden van een object (bijvoorbeeld een proteïne band) om er een rechthoek omheen te plaatsen. Als u een vorm handmatig wilt tekenen, kiest u rechthoek tekenen. Nadat u alle gewenste shapes hebt toegevoegd, klikt u op selecteren om de cursor terug te keren naar het selectiegereedschap.Opmerking: Voeg meerdere shapes toe in een logische volgorde, omdat de gegevens worden gesorteerd op een ID-nummer dat opeenvolgend wordt gegenereerd. Achtergrond aftrekken: Als u achtergrondruis wilt aftrekken, klikt u op de eerste knop in de achtergrond groep en selecteert u mediaan in het vervolgkeuzemenu. Stel de randbreedte in op 3 in de achtergrond dialoog en selecteer de segmenten die u wilt gebruiken voor de achtergrond berekening. Wanneer u kiest welke segmenten u wilt gebruiken, selecteert u segmenten die de achtergrond van de afbeelding het beste vertegenwoordigen.Opmerking: Achtergrondruis kan de signaal kwantificering beïnvloeden, dus het moet worden afgetrokken om nauwkeurig het signaal van de vormen van belang te berekenen. Trim signaal en trim achtergrond-optioneel: Bestanden die zijn geïmporteerd in JPG-, PNG-of TIFF-indeling vertonen mogelijk pixel verzadiging: gemarkeerde/heldere gebieden binnen een eiwit band. Trim signaal en Trim achtergrond (bkgnd) verwijdert verzadigde pixels uit de analyse. Om deze waarden te bekijken, Voeg Trim signaal en Trim bkgnd aan een tabel door te klikken op de Columns knop rechts van de tabel weergave.Opmerking: Pixel verzadiging kan leiden tot onbetrouwbare kwantificering. Verzadigde pixels kunnen alleen worden verwijderd als minder dan 5% van de pixels in een vorm verzadigd zijn. Gegevens exporteren: Klik op het tabblad vormen boven de tabel. Voor densitometrie zijn waarden in de kolom signaal vereist. Signaal is de som van de pixel intensiteitswaarden (totaal) voor een vorm minus het product van de Bkgnd en het gebied. Klik op de knop rapport. Klik op Opslaan als of Start spreadsheet.Signaal = totaal – (Bkgnd x gebied)Opmerking: Het tabblad shapes bevat een tabel met kwantitatieve waarden, waaronder signaal, totaal, gebied en Bkgrnd. Kwantificerende eiwit uitdrukking: Bereken in de opgeslagen spreadsheet de genormaliseerde uitdrukking van het eiwit van belang voor elke rijstrook of variabele door het verkregen signaal voor het eiwit van belang te delen door het signaal voor de corresponderende proteïne-ladings controleband.Opmerking: Vergelijkingen tussen de bedragen van een genormaliseerd eiwit van belang over nucleaire en cytoplasmorische fracties kunnen niet direct worden vergeleken vanwege de verschillende laden controles gebruikt om te onderscheiden van nucleaire en cytoplasmorische fracties. Vergelijkingen binnen afzonderlijke fracties, bijvoorbeeld na medicamenteuze behandeling, zijn echter geschikt. Afbeelding exporteren voor publicatie of presentatie: Klik op het tabblad afbeeldingen dat boven de tabel is gevonden en klik vervolgens op de afbeelding die u wilt exporteren. Als u de afbeelding voor een diapresentatie of andere digitale indelingen gebruikt, klikt u op het softwarepictogram, plaatst u de muisaanwijzer op exporteren en klikt u op afbeelding voor digitale media. Sla de afbeelding op als een JPG-, PNG-of TIFF-bestand, indien nodig.