Summary

Generierung von mehrzelligen humanen primären Endometrium-Organoiden

Published: October 04, 2019
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Summary

Ein Protokoll zur Erzeugung menschlicher primärer Endometrium-Organoide, die aus epithelialer und stromaler Zellen bestehen und Eigenschaften des nativen Endometriumgewebes beibehalten, wird vorgestellt. Dieses Protokoll beschreibt Methoden von der Erfassung des Gebärmuttergewebes bis zur histologischen Verarbeitung von Endometriumorganoiden.

Abstract

Das menschliche Endometrium ist eines der hormonell ansprechbarsten Gewebe im Körper und ist für die Etablierung einer Schwangerschaft unerlässlich. Dieses Gewebe kann auch krank werden und Morbidität und sogar Tod verursachen. Modellsysteme zur Untersuchung der Humanendometriumbiologie sind auf In-vitro-Kultursysteme einzelner Zelltypen beschränkt. Darüber hinaus vermehren sich die Epithelzellen, eine der wichtigsten Zelltypen des Endometriums, nicht gut oder behalten ihre physiologischen Merkmale in der Kultur, und so bleibt unser Verständnis der Endometriumbiologie begrenzt. Wir haben zum ersten Mal Endometrium-Organoide erzeugt, die sowohl epitheliale als auch stromale Zellen des menschlichen Endometriums bestehen. Diese Organoide benötigen keine exogenen Gerüstmaterialien und organisieren sich gezielt so, dass Epithelzellen die sphäroidartige Struktur umfassen und mit Stromalzellen in der Mitte polarisieren, die Kollagen produzieren und absondern. Östrogen, Progesteron und Androgen-Rezeptoren werden in den epitheliaalen und stromalen Zellen exprimiert und Die Behandlung mit physiologischen Niveaus von Östrogen und Testosteron fördern die Organisation der Organoide. Dieses neue Modellsystem kann verwendet werden, um normale Endometriumbiologie und Krankheiten auf eine Weise zu studieren, die vorher nicht möglich war.

Introduction

Das menschliche Endometrium säumt die Gebärmutterhöhle und dient als erster Kontakt für den Embryo während der Implantation. Das Endometrium besteht aus luminalen und drüsen Epithelzellen, unterstützenden stromalen Fibroblasten, Endothelzellen und Immunzellen. Zusammen bilden diese Zelltypen das Endometriumgewebe, das eines der reaktionsschnellsten Gewebe für Sexualsteroidhormoneist 1. Die Veränderungen, die während jedes Menstruationszyklus auftreten, sind auffallend. Ein angemessenes Wachstum und eine Umgestaltung des Endometriums ist erforderlich, damit eine Embryoimplantation möglich ist. Eine aberrante Reaktion auf Östrogen und Progesteron kann zu einem feuerfesten Endometrium führen, das keine erfolgreiche Etablierung einer Schwangerschaft zulässt und sogar zu Krankheiten wie endometriener Neoplasie führen kann.

Um die Hormonreaktionen und wesentlichen Veränderungen im Endometrium zu untersuchen, wurden Zellen aus Endometriumgeweben, die von Patienten während der Operation oder der Endometriumbiopsie entnommen wurden, in der Zellkultur vermehrt. Endometrium-Stromalzellen vermehren sich bevorzugt und vermehren sich leicht, und der durch Progesteron induzierte Differenzierungsprozess kann in vitro rekapituliert werden. Als Ergebnis wurde während dieses Differenzierungsprozesses viel gelernt, die so genannten Dezidualisierung2,3. Der andere große Zelltyp im Endometrium, die luminalen und drüsigen Epithelzellen, wachsen jedoch nicht gut als traditionelle Monolayer, verlieren Polarität, werden seneszierend und haben ein begrenztes proliferatives Potenzial. Infolgedessen ist weniger über ihre Biologie und ihre Rolle im menschlichen Endometrium bekannt. Da viele Neoplasie aus den Epithelzellen stammen, müssen Mechanismen, die mit Hyperplasie oder Transformation in Krebszellen verbunden sind, noch vollständig definiert werden. Darüber hinaus haben Studien festgestellt, dass die Hormonreaktion die intimen parakrinen Aktionen zwischen den epitheliaalen und stromalen Zellen des Endometriums4,5umfasst.

Kürzlich wurde eine dreidimensionale (3D) Organoidkultur von endometriellen Epithelzellen von zwei unabhängigen Gruppen6,7, die erste Berichte über Organoide aus Endometriumgewebe sind. Diese Organoide bestanden aus endometrialen Epithelzellen, die in eine Proteinmatrix (Tabelle der Materialien)eingebettet waren, und enthielten kein wichtiges hormonell reaktionsfähiges Fach des Endometriums, die stromalen Fibroblasten. Da die Matrixproteine von Los zu Los variieren und Signalwege auslösen können, die nicht unbedingt im Gewebe vorkommen, wäre es ideal, die Matrixproteine durch Komponenten des Endometriums zu ersetzen. In der aktuellen Studie wird ein Protokoll zur Erzeugung von gerüstfreien menschlichen Endometriumorganoiden epitheliale und stromalen Zellen des menschlichen Endometriums vorgestellt. Das Vorhandensein von Stromalzellen bietet nicht nur die Unterstützung für Epithelzellen, sondern auch die notwendigen parakrinen Aktionen, die für die Endometriumhormonreaktion4,8,9 wichtig sein sollen. .

Das neue multizelluläre Endometriumorganoid bietet ein Modellsystem des Endometriums, das einfach zu erzeugen ist und sowohl epitheliale als auch stromale Zellen umfasst. Diese Organoide können verwendet werden, um langfristige hormonelle Veränderungen und frühe Ereignisse von Krankheiten wie Tumorigenese aufgrund von hormonellen Ungleichgewicht oder exogene Beleidigungen zu studieren. Die Komplexität dieser Organoide könnte schließlich auf andere Zelltypen erweitert werden, einschließlich endotheliale und Immunzellen mit möglicherweise myometrialen Zellen, um die Physiologie des menschlichen Gewebes wirklich nachzuahmen.

Protocol

Endometriale Proben wurden von prämenopausalen Frauen gesammelt, die sich einer routinemäßigen Hysterektomie für gutartige Gebärmuttererkrankungen im Northwestern University Prentice Women es Hospital unterziehen, gemäß einem vom Institutional Review Board genehmigten Protokoll. Die schriftliche Zustimmung wurde von allen Frauen eingeholt, die in die Studie einbezogen wurden. 1. Herstellung von Agarose-Formen Vor Beginn der Zellisolierung 1,5% Agarose-Mikroformen(Mater…

Representative Results

Ein Schaltplan des Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt. Uterusgewebe wurde aus der Operation gewonnen, nachdem es von Pathologen untersucht wurde. Die Endometriumschleimhaut wurde durch Abkratzen vom Myometrium getrennt und das Endometriumgewebe enzymatisch zu den Zellen verdaut, wie im Protokoll beschrieben. Epithel- und Stromalzellen wurden in den Agaroseformen in Mikrobrunnen zugegeben. Nach 7 Tagen in der Kultur wurden Organoide mit E und T für weitere 7 bis 14 Tage behandelt. …

Discussion

Wir haben menschliche Endometrium-Organoide erzeugt, die aus epitheliaalen und stromalen Zellen des Endometriums bestehen, ohne die Verwendung von exogenen Gerüstmaterialien. Während bereits gezeigt wurde, dass primäre endometriale Epithelzellen Organoide bilden können6,7, wurden diese Zellen in eine gelatineartige Matrix von Proteinen eingebettet, die von Maussarkomzellen abgesondert wurden (siehe Tabelle der Materialien), um sphäroidartige…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde vom NIEHS/NIH/NCATS UG3 Grant (ES029073) und dem Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge Fund (JJK) finanziert. Wir möchten die Northwestern Pathology Core Facility für die Verarbeitung der festen Organoide für paraffinige Einbettung würdigen. Wir möchten das gesamte UG3-Team einschließlich der Labore Woodruff, Burdette und Urbanek für die aufschlussreichen Diskussionen und Kooperationen würdigen.

Materials

Agarose HS, molecular biology grade Denville Scientific CA3510-6
Agarose molds Sigma-Aldrich Z764043 (https://www.microtissues.com/)
Ammonium chloride (NH4Cl) Amresco 0621
β-Estradiol Sigma-Aldrich E2257
Collagenase, Type II, powder Thermo Fisher Scientific 17101015
Dispase Corning 354235
DNase I Sigma-Aldrich D4513
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Eosin Stain VWR 95057-848
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody Thermo Fisher Scientific RM-9101-S
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium Sigma-Aldrich F6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV 1x without calcium, magnesium, and phenol red
Hematoxylin Stain Solution Thermo Fisher Scientific 3530-32 Modified Harris formulation, mercury free
Heparin solution STEMCELL Technologies 07980 added to MammoCult media
Hydrocortisone stock solution STEMCELL Technologies 07925 added to MammoCult media
Organoid media – Mammocult STEMCELL Technologies 05620 supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone
Paraformaldehyde, 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Phosphate buffered saline, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant Agilent Technologies M356801-2
protein matrix – Matrigel BD Biosciences 356231
Purified mouse anti-E-cadherin antibody BD Biociences 610181 Clone 36
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] Abcam ab92547
RNA lysis and isolation kit Zymo Research R2060
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6014
Testosterone Sigma-Aldrich 86500
Trichrome Stain Abcam ab150686
Wax film – Parafilm VWR 52858-000

References

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Citer Cet Article
Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60384, doi:10.3791/60384 (2019).

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