我们提出了一个显微注射系统,用于电生理学和辅助交付实验探头(即纳米传感器,微电极),可选配药物输注。广泛可用的微流体成分与包含探头的导管耦合。包括一个微注射的分步协议,在猴皮层中注入木糖醇时的结果。
这种显微注射系统设计用于药物输注、电生理学以及实验探头(如微电极和纳米传感器)的输送和检索,经过优化,可在清醒、有行为的动物中重复使用。显微注射系统可配置为多种用途:(1) 管路的简单排列,用于放置实验探头,否则该探头太脆弱,无法穿透杜拉母体;(2) 药物的微流体注入,或者独立或耦合到包含实验探头(即微电极、纳米传感器)的导管上。在该协议中,我们解释了微喷剂的逐步构造、微流体成分的耦合以及系统在体内的使用方案。该系统的微流体组件允许在纳米升尺度上输送体积,渗透伤害最小。药物输注可以独立进行,也可以与实验探针同时进行,如在醒着、行为动物中的微电极或纳米传感器。该系统的应用范围从测量药物对皮质电活动和行为的影响,到根据探头或纳米传感器测量在行为表现中了解特定皮层区域的功能。为了演示该系统的一些功能,我们提供了一个在工作记忆任务期间为恒河猴前眼场(FEF)可逆失活而输液的粘液输液的例子。
电生理学和药物注射方法在神经科学中广泛用于研究神经元活动和行为,在体内,在啮齿动物和灵长类动物中。在过去的三十年里,早期注射模型的改进使得一种更精确和侵入性更少的技术,同时在特定的大脑部位1,2,3同时记录和药物注射。尤其对于灵长类动物来说,如果这项技术用于研究需要训练有素的动物的高级认知功能,则精确提供小体积且组织损伤最小的能力至关重要。最近的进展包括慢性电生理和化学测量结合刺激使用植入探针4,和联合记录和微流体药物交付最近在啮齿动物5试验。这里描述的注射系统允许电生理记录,刺激和精确的药物输送,并已成功地在多个灵长类实验室6,7,8。
具有神经科学应用的精密专用传感器(如纳米传感器9、10)的可得性日益普及,需要一种可靠的方法,在不损坏脆弱的纳米级器件或微电极尖端的情况下,使探测器通过杜拉体。
我们设计了一个显微注入系统,克服了使用现成的低成本组件组合这些方法的技术挑战,并便于实现两个主要功能:(一) 能够放置脆弱的实验探头,例如微电极或纳米传感器,通过杜拉母体和神经组织,防止任何损坏。此功能允许将实验探针放置在目标位置,通过使用导管作为穿过神经组织的指南来传递。(二) 使用微电极进行电生理记录和电刺激与药物注射相结合的实验的能力。
我们的系统使用导管穿透杜拉,以及一个管状功能,用于药物输送(当使用系统进行微输液)和提供额外的保护微电极或纳米传感器(当通过杜拉和神经组织)。该系统易于构建,具有广泛的商业可用组件,价格低廉且易于查找。我们使用小直径的导管(外径 OD = 235 μm,内径 ID = 108 μm),将穿透损伤降至最低。
在这里,我们提出了微喷液结构及微流体系统的配置的分步说明。我们解释使用微注射所需的步骤,无论是独立或耦合到药物注射的微流体系统。类似的方法可以应用于任何脆弱的实验探头,如纳米传感器9,10。探头可以正面或背面加载到管中(取决于设计),在穿透杜拉和神经组织时可防止损坏。我们提供来自非人类灵长类动物体内实验的示例数据,其中我们使用钨微电极进行电刺激,随后在前眼场(FEF)中注射粘膜醇,而动物则执行记忆引导囊(MGS)任务。
目前有几种方法可用于同时进行药物输送和电生理学。我们的系统旨在具有独立或与药物注射相结合进行录音的灵活性,并能够通过 dura 母体和神经组织精确放置任何脆弱的实验探头,如纳米传感器或微电极,防止任何损坏。该系统允许用肉眼精确控制药物输注量(17 nL 精度,如我们实验室3中先前的研究所示)。
有更专门的系统压力注入较小的直径12。这些系统允许多个录制站点,但控制系统所需的软件和硬件的复杂设置为每个组件带来了更高的成本,并且与尚未大规模商业化的实验探头接口的灵活性较低。此外,我们的注射剂不需要慢性植入物,并提供很大的灵活性:与生物传感器兼容,以测量化学和电生理信号,并能够注入药物,以及有可能测量局部药物输注对这些反应的影响。
该设计允许实验探头在杜拉穿透后突出,以避免损坏探头的结构。此功能允许设备的多功能性,穿透杜拉,而不会有损坏任何实验探头的风险,如纳米级纳米传感器10。但是,有一个长度的限制,可以突出,限制圈的圈数,限于±1毫米的标准套圈。由于小管状直径(228 μm),组织损伤最小。
在实验中,我们展示,该系统用于执行控制性细胞的传递,以可逆的FEF失活,同时与电刺激或细胞外记录(单个神经元,局部场势)使用微 电极。在FEF的这个实验要求对FEF进行微刺激,以确认失活前的囊肿载体,并且药物被注入来研究可逆FEF失活期间的工作记忆。在药物注射前后,不可能保持来自同一分离的单神经元的记录;然而,我们能够在输液前后记录当地的现场潜力。在这里,我们展示了一个结合注射、记录和电刺激的实验。
一旦设置,该方法是非常可靠和可靠的。然而,由于小管和端口内小分子(如盐)的沉淀,每次实验后需要彻底冲洗,以保持微流体无障碍物和泄漏。由于整个电路简单,每个组件都可以独立更换,以便进行故障排除。
虽然该方法在非人类灵长类动物的FEF区域得到证明,但该原理可以应用于任何其他需要电刺激、记录和药物注射组合的脑区,在啮齿动物大小或更大的物种中。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了美国国家卫生研究院(NIH)的资助,向纽约大学眼科和视觉科学系提供EY026924和EY014800(资助B.N.),这是一项来自研究预防失明的无限制赠款。犹他州,以及亨利·萨缪里工程学院和加州大学欧文分校电气工程系向R.E.提供的启动资金。这种方法基于蒂林·摩尔博士实验室开发的类似方法的先前报告,发表在《2011年神经科学方法杂志》上。作者感谢凯尔西·克拉克博士对手稿的评论。
3-port manual valves | LabSmith | Manual 3-Port Selector Valve (MV201-C360) | https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26 |
Cannulae | Vita Needle Company | 304 Stainless steel tubing, Outer Diameter 228μm, Inner Diameter 165μm | https://www.vitaneedle.com/assets/files/Vita_Needle_Master_Tubing_Gauge_Chart.pdf |
Cleaving stone | Molex | Cleaving stone 1" x 1" (part No. 1068680064) | Highly recommended to follow method for cleaving capillary tubing: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf |
Clorhexidine diacetate | Walmart | Nolvasan solution disinfectant (AAP311) | Used for microfluidic circuit flushing, dissolved at 20 g/L |
Custom adapter | Custom provider | – | Custom machined adapter to connect microinjectrode to hydraulic microdrive |
Driver | LabSmith | T7 TORX driver for installing breadboard screws (LS-TORX Driver) | https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25 |
Epoxy glue | LabSmith | Two-part high-strength epoxy adhesive (LS-EPOXY) for metal and plastic bonding | https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24 |
Ferrule | LabSmith | One-Piece Fitting (C360-100) for connecting capillary, thru hole sized for 360μm OD capillary | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24 |
Ferrule plug | LabSmith | One-Piece Plug (C360-101) for use in any -C360 port | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24 |
Ferrule wrench | LabSmith | 1/8" hex wrench for installing one-piece fittings and plugs (LS-HEX 1/8" Hex Wrench) | https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24 |
Gastight syringe | Hamilton Company | 500μL gastight syringe model 1750 (81220) and 1mL gastight syringe model 1001 (81320) | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top |
Gold pins | Aim-Cambridge | Male gold plated crimp-on connector pin (40-9856M) | https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html |
Lint-free wipes | Kimberly Clark | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task | Lint-free wipes, used to identify leaks in the system |
Liquid food color | McCormick & Co. | Water based, black liquid food color (52100581873) | https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color |
Low viscosity oil | Clearco Products Co. | Pure Silicone Fluid Octamethyltrisiloxane with a viscosity of 1cSt at 25°C (PSF-1cSt) | http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html |
Luer-Lock connector | LabSmith | Luer-Lock Adapter (C360-300), female fitting for connecting Luer Lock syringe to 360μm capillary tubing | https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24 |
Micro drill bits | Grainger | Micro drill bit, 0.23mm (414H85) | https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits |
Microelectrode | FHC | Metal microelectrode, tungsten with epoxy insulation | https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes |
Oil hydraulic micromanipulator | Narishige Group | Oil Hydraulic Micromanipulator with guide tube attached (MO-96) | http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html |
Polymicro Capillary Tubing | Molex | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing (TSP150375), Outer Diameter 375µm, Inner Diameter 150µm | https://www.molex.com/webdocs/datasheets/pdf/en-us/1068150024_CAPILLARY_TUBING.pdf |
Programmable syringe pump | Harvard Apparatus | Standard Infuse/Withdraw Pump, programmable (70-2213) | https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html |
Ruler | Empire | Stainless steel 6" Stiff ruler (27303) | http://www.empirelevel.com/rulers.php |
Screw set | LabSmith | Valve mounting screw set (LS-SCREWS .25), thread-forming screws (2-28 x 1/4”) to mount valves to breadboard | https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24 |
Standard Breadboard | LabSmith | 4" x 6" platform (LS600), with 0.25" hole spacing for mounting fluid circuit | https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24 |
Sterile saline (sodium chloride) 0.9%. | Baxter | 0.9% Sodium Chloride sterile | Sterile Intravenous Infusion |
Sterile syringe filters | Millipore Sigma | MilliporeSigma™ Millex™-GP Sterile Syringe Filters with PES Membrane (SLGPM33RS) | https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs |
Stoelting manual microsyringe pump | Stoelting Company | Manual infusion/withdrawal pump (51222) | https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html |
T-junction | LabSmith | Interconnect tee (C360-203) for combining flow streams, for use with 360μm OD capillary tubing | https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24 |