Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

Le microglia, che rappresentano il 5%-10% di tutte le cellule neurali, sono macrofagi residenti sparsi in tutto il sistema nervoso centrale (SNC)¹. Protetto dietro barriera emato-encefalica, microglia tipica in un cervello adulto sano contengono molti processi fini che si estendono rapidamente e si ritraggono per interagire con i neuroni e altre cellule gliali nel parenchyma. La microglia può anche adottare la morfologia ameboide associata ad una maggiore funzione fagocitica durante specifiche fasi di sviluppo o su sfide immunitarie in lesioni e malattie^1,2,3,4. Recenti scoperte entusiasmanti hanno chiaramente dimostrato che le microglia non sono affatto astanti passivi a segnali derivati dal cervello o patologici, ma svolgono un ruolo fondamentale nel controllo dello sviluppo cerebrale e dell’omeostasi, ad esempio, sostenendo la sopravvivenza neuronale, potando sinapsi immature, promuovendo la differenziazione delle cellule lignaggio oligodocito e l’asgiogenesi^{1 .} Man mano che le funzioni della microglia sono chiarite, l’eccitazione è ulteriormente alimentata da studi di genetica umana, che hanno dimostrato che molti geni del rischio di malattie neurodegenerative, come TREM2, sono prevalentemente o esclusivamente espressi da microglia^5,6,7. Data la loro importanza nello sviluppo e nei plausibili ruoli guidati dalle malattie, recentemente è stato compiuto un enorme sforzo verso la nostra comprensione della regolazione genica microgliale e della funzione nella speranza di trovare nuovi bersagli terapeutici per le malattie neurodegenerative^1,8.

Il sequenziamento dell’RNA (RNA-seq) consente una caratterizzazione imparziale dell’espressione genica specifica del tipo di cellula, che a sua volta guida gli scienziati a studiare le funzioni geniche nelle reti cellulari dense⁷. L’RNA-seq era stato fatto per lo più su campioni sfusi, portando alla scoperta di una firma del gene microgliale omeostatica che li distingue da altre cellule neurali e immunitarie⁹. Tuttavia, un tale approccio potrebbe trascurare le differenze molecolari e funzionali tra le microglia, in particolare quelle temporanee presenti in fase di sviluppo o associate all’invecchiamento e alla malattia. Infatti, RNA-seq unicellulare (scRNA-seq) offre la sensibilità e la risoluzione che hanno rivoluzionato il campo rivelando l’eterogeneità della microglia precedentemente sottovalutata in una varietà di contesti^2,3,10. Inoltre, a causa della presenza di altre cellule immunitarie simili all’interfaccia di circolazione del CNS, scRNA-seq fornisce informazioni che aiutano la progettazione di nuovi strumenti per separare e sezionare funzionalmente queste cellule correlate con poca conoscenza precedente^2,11.

È stata inventata una vasta gamma di piattaforme scRNA-seq, ognuna adatta per determinate applicazioni¹². In generale, i metodi basati sulle goccioline, come 10x Genomica, sono più elevati in termini di produttività con (decine di) migliaia di cellule sequenziate in ogni esecuzione e sono meno selettivi per l’input che può contenere popolazioni di cellule miste che richiedono un’ampia categorizzazione. I metodi a base di piastre forniscono una maggiore sensibilità e profondità di lettura^13,14, di solito mirando a popolazioni specifiche dallo smistamento delle cellule per rivelare sottili differenze o trascrizioni rare. Data la piccola percentuale di cellule microgliali, in particolare quelle sottopopolazioni associate allo sviluppo o alla malattia, tra tutti i tipi di cellule SNC, è spesso auspicabile isolare la microglia da una specifica regione di interesse e ottenere informazioni trascrittomiche profonde e complete per comprenderne l’eterogeneità.

Qui, forniamo dettagli su come isolare microglia da diverse regioni del cervello del topo sezionate da un singolo emisfero, che vengono utilizzate per l’RNA-seq a singola cellula (o alla rinfusa) seguendo una procedura di preparazione della libreria semi-automatica basata su lamiere. L’altro emisfero può quindi essere utilizzato per la convalida istologica. Semplificato da un metodo^{precedentemente}pubblicato 9 , questo protocollo di isolamento mira a massimizzare la resa da piccole quantità di materiali di partenza, e nel frattempo mantenere profili di espressione genica microgliale endogeni. Utilizziamo lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per arricchire la microglia (o altre cellule immunitarie correlate di interesse) in piastre di 96 pozze e diimentare i volumi di reagenti per la preparazione della biblioteca al fine di aumentare la produttività. Mettiamo in evidenza questa piattaforma scRNA-seq sensibile, anche se possono essere applicate altre strategie basate su piastre. Questo metodo può essere facilmente adattato per isolare microglia da altri tessuti sezionati, come lesioni o foci di malattia, e l’età del topo può variare in quasi tutti gli stadi postnatali. L’isolamento efficiente della microglia regionale per gli studi sulla trascrittomica a una cellula faciliterà una migliore comprensione delle loro funzioni in materia di salute e malattia.