정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

종양 성장의 분석은 국립 암 연구소의 동물 실험 윤리위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 수행되었으며 미국 국립 연구위원회의 “치료 및 사용에 대한 가이드”의 권고사항을 준수했습니다. 실험실 동물”, 미국 공중 보건 서비스의 “실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드”, 그리고 “인간적인 관리 및 실험실 동물의 사용에 대한 정책”. 1. 이식을위한 세포의 준비 참고: MDA-MB-231 인간 유방 선암세포(상업적으로 획득)는 렌티바이러스에 의한 루시퍼라아제 유전자 III 및 강화된 녹색 형광 단백질(GFP) 마커로 안정적으로 형질감염되었고 선택항생제(puromycin)의 존재하에서 성장하였다. . 1 x 106 MDA-MB-231-Luc/GFP 세포로 세포 배양을 시작하고 T75 배양 플라스크에 10% 태아 소 혈청(FBS)을 가진 프리웜(37°C) RPMI 1640 배지 15 mL을 첨가합니다. 5%CO2를가진 37°C에서 온도 조절 세포 배양 인큐베이터에서 성장하는 세포를 유지한다. 일주일에 적어도 2회 전체 매체를 교체하십시오.참고: 세포 성장을 방해 하지 마십시오 하 고 매일 세포 성장 조건을 확인 유지. 세포는 증식 단계를 유지하기 위해 85%-90% 동률에 도달할 때 배양될 필요가 있다. 세포 이식 단계 1주일 전에, 배양 플라스크내의 모든 배지를 먼저 제거한 다음, 1x 인산완충식염수(PBS)의 10mL로 2x를 헹구고, 마지막으로 배지를 완전한 배지로 대체하여 세포 배양 플라스크로부터 퓨로마이신을 제거하였다. 푸로마이신없이. 중간 첨가 및 헹구 단계 동안 세포를 방해하지 마십시오. 모든 배지 보충 단계에 대해 지금부터 선택 항생제와 함께 완전한 배지를 사용하지 마십시오. 이식에 대 한 세포를 준비 하는 날에, 트립신을 비활성화 하지 않도록 트립시니화 하기 전에 모든 완전 한 매체를 제거. 플라스크에 트립신 5 mL을 추가하여 세포를 트립시니화합니다. 세포를 모니터링하고 배양 플라스크에서 분리되어 있는지 확인합니다. 일단 세포의 대다수가 분리되면, 트립신 활성을 중화하기 위해 완전한 배지의 10 mL를 추가하십시오. 다음으로, 세포 현탁액을 50 mL 원심분리기 튜브 및 원심분리기로 ~150 x g에서 펠릿 세포로 옮긴다. 원심분리 후 상급체를 제거한 다음 1x PBS 10 mL을 추가하여 세포를 다시 중단하고 세포 계수를 준비합니다. 세포 카운터로 세포를 계산하고 25% 지하 막 매트릭스를 포함하는 차가운 1x PBS에 있는 20 x 106 세포/mL로 세포 농도를 조정합니다. 0.1 mL 1x PBS에 2 x 106 세포를 주입하고 25% 지하 막 매트릭스를 각 마우스의 제 4 유방 지방 패드에 주입합니다. 세포 이식을 위해 여분의 바늘과 주사기를 가져오고 이식 하기 전에 얼음에 세포-지하실 막 매트릭스 혼합을 유지 합니다.참고 : 주사기와 바늘에 죽은 공간이 있습니다. 바늘 및 주사기의 선택에 따라 길이, 유형 및 크기, 26 G 바늘에 0.5를 가진 결핵 주사기는 최대 70 μL 데드 스페이스10을가질 수 있다. 죽은 공간 및 기타 우발적 인 손실을 보상하기 위해 40 %-50 % 더 많은 세포 이식 믹스를 준비하십시오. 2. 정형 외 유방암 모형 및 종양 크기 측정 6주 된 암컷 아티믹 누드 마우스가 세포 이식 전에 적어도 1주일 동안 하우징 시설에 적응하도록 허용하십시오.참고: 동일한 연령의 마우스를 사용하면 데이터 변형이 줄어듭니다. 각 라운드마다, 3-4 분 동안 1 L /min의 유량으로 여과 (0.2 μm) 공기로 4 %에서 이소플루란으로 5 마리의 마우스를 마취시키고 마우스호흡률과 패턴 변화에주의를 기울이고 발가락 핀치를 사용하여 마우스가 적절한 마취 상태에 있는지 확인하십시오. 더 이상 움직이지 않으면 마우스 한 개를 제거하고 코와 입에 같은 마취를 합니다. 알코올로 왼쪽 4번째 유방 땀샘을 면봉. 미세 한 쥐 치아 집게를 사용 하 여, 4유 방 동맥 을 약간 들어 올려 25 G 바늘을 삽입 합니다. 바늘이 경사지도록 한 다음 플런저를 약간 당겨 바늘이 혈관에 부딪히지 않도록하십시오. 주사기로 혈액이 들어가지 않으면, 세포 지하 막 매트릭스 혼합물의 100 μL을 유방 지방 패드에 천천히 주입하십시오.참고: 피부 아래에 둥근 상승 영역이 나타납니다. 지하 멤브레인 매트릭스가 경화될 때까지 10-15s를 기다린 다음 바늘을 제거하십시오. 유도 챔버에 남아있는 마우스와 과정을 반복합니다. 사용한 모든 바늘과 주사기를 날카로운 상자에 놓습니다. 모든 마우스에 대해 동일한 유선 주사 부위를 사용하십시오. 사출 부위를 주의 깊게 주시하고 주사 부위에서 누출되는 세포 이식 혼합물에 주의하십시오.참고 : 몇 분 이내에 마우스가 의식을 회복하기 시작합니다. 이종이식은 종양 크기 측정 전 7-10일 동안 중단 없이 자유롭게 자랄 수 있도록 하십시오. 모든 마우스에 대한 이종이식 크기를 검사합니다. 캘리퍼로 종양 크기를 측정합니다. 다음 방정식으로 종양 부피(mm3)를결정합니다.여기서 L은 가장 긴 치수이고 W는 L에 수직인 가장 짧은 치수입니다. 평균의 표준 편차를 초과하는 이상값을 식별하고 제거합니다. 실험에 비슷한 종양 크기의 마우스만 사용하십시오. 무작위로 다른 처리 단으로 마우스를 분할하고 처리를 시작합니다. 일주일에 2 배 캘리퍼스로 종양 크기를 측정하십시오. 이종이식의 모든 물리적 변화 (즉, 괴사, 열상)를 기록하십시오. 3. 생체 내 생물 발광 및 생체 내 형광 이미징 참고: 본 연구에서는 2차원 생물 발광 및 형광 이미징이 실험의 종점에서 수행됩니다. 생물 발광 이미징(BLI)은 16비트 냉각 CCD 카메라및 가열된 이미징 스테이지가 장착된 상용 전임상 광학 스캐너를 사용하여 수행하였다. 이미징 전에, 유도 챔버에서 최대 5 개의 종양 베어링 마우스를 여과 (0.2 μm) 공기로 3-4 분 동안 1 L / min의 공기로 설정하여 마취하십시오. 인덕션 챔버가 환기 후드 내부에 보관되어 직원이 이소플루란에 노출되는 것을 최소화하십시오. D-루시페린(150 mg/kg)을 27 G 바늘을 사용하여 복강 내 경로로 마취된 마우스에 투여하고 마취된 마우스를 이미징 챔버로 옮긴다. 스캐너 이미징 챔버에서 이소플루란을 2%-2.5%로 유지하고O2를 1L/min의 유속 캐리어로 유지합니다.참고 : 마취 유도 챔버, 이미징 테이블 (단계가 가열되지 않은 경우) 및 절차 후 복구 케이지 아래에 가열 된 패드를 유지하여 절차 중에 ~ 37 °C에서 마우스의 체온을 유지합니다. 연구 마우스를 이미징하기 전에, 3개의 추가 종양 베어링 마우스(어떤 연구 그룹에 할당되지 않은 동물)를 총 40분 간격으로 이미징하여 루시페린 역학을 얻어내십시오: 여기 필터 차단, 방출 필터 개방, f/stop 1, FOV-D, 중간 비닝(8 x 8), 및 자동 노출. 측정된 피크 생물 발광 신호를 사용하여 모든 후속 시점의 최적의 이미지 수집 시간 창을 정의합니다. 전이 화상 진찰을 능력을 발휘하는 동안, 검은 장갑에서 잘라낸 소매로 그것을 엄호해서 1 차적인 종양에서 높은 BLI 신호를 차폐하십시오. 3.3단계에서 설명한 것과 동일한 파라미터를 사용하여 마우스의 복부 측이 폐 전이 이미징을 위해 카메라를 향하고 있고, 뇌 전이 이미징을 위해 카메라를 향한 마우스의 등쪽을 사용하여 이미지를 획득한다.참고 : 최소한의 자동 발광으로 하나를 선택하는 검은 장갑의 몇 가지 다른 브랜드를 테스트하는 것이 필수적이다. 스캐너 및 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 흉강 또는 뇌에 대한 표준 모양 영역(ROI)을 그려 관심 기관 전체가 전이성 부담을 평가하도록 보장합니다. 생물 발광 (BL) 출력을 총 플럭스 (광자 / 초)로 정량화합니다. BLI 직후,CO2 질식(ACUC 지침 및 기관에서 승인한 동물 프로토콜에 따라)을 통해 마우스를 안락사시키고 생체 내 이미징을 위해 해부 가위와 집게로 폐와 뇌를 추출합니다.참고: 생체 내 이미징 및 폐 전이 결절 계수에 대해 추출된 폐는 호환되지 않는 절차로 인해 동일한 마우스에서 수행될 수 없습니다. 1 x PBS로 모든 장기를 신속하게 헹구어 피상적 인 혈액 얼룩을 제거하고 낮은 자동 형광, 검은 색 플라스틱 판에 장기를 놓습니다. GFP 검출을 위한 12비트 CCD 카메라가 장착된 스펙트럼 언혼합 기능(고체 액정 파장 튜닝)을 갖춘 다중 스펙트럼 형광 스캐너로 기관을 운반합니다. 추출된 장기 및 비종양 베어링 대조군 마우스의 다중 스펙트럼 GFP 이미지(여기 필터 = 457±23 nm; 방출 필터 = 490 nm 긴 패스)를 10 nm의 스텝 크기에서 500-720 nm를 스캐닝하여 획득한다. 비종양 베어링 대조군 마우스의 절제된 장기를 사용하여 자가형광을 교정합니다. 다중 스펙트럼 GFP 이미징 후 최적의 이미징 설정을 결정합니다. 모든 표적 기관의 이미지 수집을 수행하고 제조업체의 프로토콜에 따라 이미지 분석(즉, 자동 형광및 스펙트럼 언혼합 절차에 대한 GFP에 대한 스펙트럼 라이브러리 생성)을 수행합니다. 4. 전이성 유방암 세포의 분자 검출 생체 내 화상 진찰 후에, 스냅은 액체 질소에 있는 전체 두뇌를 동결하고 DNA 추출을 위한 준비가 될 때까지 냉동실에 -80°C에서 저장합니다. DNA 추출을 위해, DNA 용해 완충제의 2 mL를 가진 5 mL 균질화 관에 전체 두뇌를 두십시오. 50에서 전원 설정이있는 균질화를 사용하여 스냅 냉동 전체 뇌 조직을 균질화하십시오. 뇌 조직이 완전히 균질화되면, 1 mL 현탁액 (용해)을 DNase가없는 RNase및 RNase가없는 2 mL 미세 원심 분리 튜브로 옮기고 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA를 계속 분리합니다.참고: 이월 DNA 오염을 최소화하기 위해 먼저 DNase 프리 및 RNase 가없는 물로 75 % 에탄올로 헹구고 1 M NaOH 용액으로 헹구고 DNase가없는 75 %의 에탄올로 헹구고 각 샘플 후 균질 화제를 철저히 청소하고 RNase-free 물은 DNA 잔류물을 효과적으로 줄이고 파괴합니다. 0.5 mL의 100% 에탄올을 DNA 매해 완충액에 첨가한다. 샘플을 반전하여 혼합하고 실온에서 3분 동안 보관합니다.참고: 너무 여러 번 또는 너무 힘차게 반전하지 마십시오. DNA는 양모와 같은 침전물로 볼 수 있습니다. 파이펫 팁을 사용하여 DNA를 신선한 DNase 프리 및 RNase 프리 2 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김을 제거합니다. 샘플을 1 분 동안 공기 건조시키십시오. 1 mL 75 % 에탄올을 추가하고 DNA 샘플을 세척하기 위해 미세 원심 분리 튜브 를 3−6x 반전시. 파이펫팅으로 세척한 후 에탄올을 폐기합니다. 세척 단계를 2x 반복합니다. 10s에 대한 DNA 샘플을 공기 건조. 이어서 DNA 샘플을 용해시키기 위해 8 mM NaOH의 52 μL을 첨가하였다. DNA 정립을 위한 DNA 샘플의 파이펫 2 μL을 사용하고, 농도 조정 후 실시간 PCR 분석에 나머지 50 μL을 사용한다.참고: NaOH는 DNA 샘플을 완전히 용해시키는 데 도움을 줍니다. 분광광도계로 각 DNA 샘플의 2 μL을 정량화하고 품질 검사 참조로 A260/280 사이의 흡광도 비율을 사용합니다. 이 수식으로 DNA 농도를 계산합니다. DNA 농도를 50 ng/μL로 조정합니다. 각 DNA 샘플에 대해, 실시간 PCR 분석에 대한 시작 템플릿으로 DNA 50 ng를 사용한다. DNA 샘플을 희석하기 위해 8 mM NaOH 용액 또는 DNase 가없는 RNase가없는 물을 사용하십시오. 멸상 반위 부위를 침입하고 식민지화한 전이성 세포에서 GFP 태그의 실시간 PCR 검출을 위한 오픈 소스 프라이머 설계 웹 포털을 사용하여 사내 외인성 녹색 형광 단백질(GFP) 서열에 특이적인 프라이머 쌍을 설계한다.참고 : 이 연구는 F를 사용: 5′-AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3′, R: 5′-TGCTCAGGTAGTGTGTCG-3′. 빠른 실시간 PCR 시약과 빠른 실시간 PCR 프로토콜을 지원하는 실시간 PCR 기계를 사용하십시오. 일반 30 사이클 증폭 단계 이외에, 임의의 비특이적 증폭의 검출을 위해 실행의 끝에 해리 곡선 단계를 추가한다.참고: 분자 검출을 위해 다음 조건이 사용되었다: 95°C 2 분 고온 스타트, 95°C 5s의 40 사이클, 60°C 15s, 및 마지막으로 용융 곡선 분석. GFP 앰플리곤의 크기는 135bp입니다. 순진한 마우스 뇌 DNA (MDA-MB-231 세포 임플란트가 아님)를 음성 대조군으로 사용하십시오. MDA-MB-231-GFP/Luc 세포에서 추출한 DNA를 양성 대조군으로 사용하십시오. DNA 템플릿없이 모든 PCR 시약을 무 템플릿 제어 (NTC)로 추가하십시오.참고: 각 PCR 분석에 대해 PCR 제어가 필요합니다. 5. 폐에서 전이성 유방암 세포 검출 전이성 폐 결절 계수에 대해 선택된 마우스 소군의 경우, 생체 내 이미징 직후 이소플루란(2.2단계)으로 마우스를 마취시키고, 혈액 수집을 위해 심장 천자를 수행한 다음 자궁 경부 탈구에 의해 안락사시한다. 해부 가위로 가슴 구멍을 열고 심장과 흉선과거를 잘라 기관을 노출시다. 부인의 용액이 들어있는 22 G 바늘로 10 mL 주사기를 기관에 삽입하십시오. 붕괴된 폐가 부인용액의 ~2 mL로 부어오를 때까지 주사기 플런저를 밀어 넣습니다. 폐가 팽창되면 주사기와 바늘을 제거하십시오. 전체 폐를 Bouin의 용액이 들어있는 15 mL 튜브에 넣고 튜브를 몇 번 부드럽게 반전시키고 실온에서 24 시간 동안 담가 둡니다. 24 시간 후, 튜브에서 Bouin의 용액을 제거하고 폐를 물로 헹구고 70 % 에탄올로 튜브에 다시 놓습니다. 해부 현미경을 사용하여 폐 표면에 전이 (흰색 패치 또는 작은혹)를 계산합니다. 6. 데이터 수집 및 분석 쉬운 데이터 입력, 수집 및 관리를 위해 전자 스프레드시트에 종양 볼륨 데이터뿐만 아니라 생체 내 및 생체 내 이미징 데이터를 기록합니다. 실험이 끝나면 모든 데이터를 전자 스프레드시트및 통계 소프트웨어로 전송하여 데이터 플로팅 및 통계 분석을 합니다.