脱氧核糖核酸介导基板无机结构纳米图案用于传感应用

1. DNA折纸的设计 注：在本协议中，使用二维（2D）弓形DNA折纸结构（图1）34描述纳米图案处理过程。要设计新的 DNA 折纸形状，请遵循以下准则： 使用caDNAno35设计所需的形状和所需的DNA折纸的主食链序列。要生成平面的单层折纸，请使用 caDNAno 的方形格子选项，并通过跳过设计中的一些基块（参见图 1和补充 caDNAno 文件）手动调整交叉间距，以删除产生的结构扭曲从方格包装36，37。 用含有聚T（8 nt）悬伸的绞线延伸每个DNA螺旋的末端;这将防止通过钝端基堆叠交互（图 1和补充 caDNAno 文件）对对象进行多面化。 运行设计的计算分析。CanDo38，39可用于预测 DNA 折纸的三维 （3D） 形状和结构刚度。CanDo 也是一个有用的工具，用于迭代扭曲校正所需的基本跳过数，并相应地调整设计。 在 caDNAno 中，选择首选的脚手架长度并生成折叠结构所需的钉线。对于蝴蝶结结构，使用 7249 nt 长 M13mp18 脚手架和 205 根独特的钉线（参见补充 caDNAno 文件）。注：还有其他计算工具可用于设计DNA折纸结构40，41，42，43。根据所选择的工具/软件，其他模拟工具也可以使用43，44。 2. DNA折纸大会 通过混合弓形结构所需的所有寡核苷酸（共205个订书针）34，使主食绞线库存。寡核苷酸应具有相同的初始浓度（例如，在无RNase水中为100μM）。 通过混合 20 μL M13mp18 支脚手架链（p7249 型，在 100 nM 时），40 μL 的订书针溶液，在 0.2 mL PCR 管中制备 100 μL 的 DNA 折纸折叠反应混合物，其中每股的订书针含量为 500 nM（与订书针相比，其产量为 10 倍摩尔多余到支架）和 40 μL 的 2.5x 折叠缓冲液 （FOB）。FOB含有三聚一苯乙烯-乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液（TAE），辅以MgCl2。有关FOB成分浓度，见表1。 在热循环器中从 90°C 到 27°C 中对反应混合物进行退火。使用表 2 中介绍的热折叠斜坡。 3. DNA折纸的纯化 注：使用无损聚（乙二醇）（PEG）纯化方法，可以从DNA折纸溶液中去除过量的主食链。该协议改编自斯塔尔等人45。 用600μL的1xFOB稀释组装的DNA折纸结构的200μL（见表1），以获得800μL的起始体积。 将稀释后的DNA折纸溶液1：1与800 μL的PEG沉淀缓冲液（15% PEG 8000 （w/v）、1x TAE、505 mM NaCl）混合，并通过来回移液彻底混合。 在 14，000 x g和室温下将混合物离心 30 分钟。 使用移液器小心地去除上清液。 加入 200 μL 的 1x FOB，通过移液轻轻混合。也可以添加不同量的1xFOB，以获得所需的DNA折纸浓度。 要重新溶解DNA折纸结构（管底的小透明颗粒），在室温下孵育PEG纯化DNA折纸结构过夜。 使用 UV/Vis 分光光度计测量波长为 260 nm 的吸收率，估计 PEG 纯化后的 DNA 折纸浓度。使用比尔-兰伯特定律和1.1×108 M-1 cm-1的消光系数计算6。PEG纯化后的典型DNA折纸浓度为15-20 nM。 将PEG纯化DNA折纸结构储存在4°C。DNA折纸结构通常稳定数月，因此可以准备大量库存供以后使用。注：过量的主食绞线也可使用其他纯化技术46去除，如自旋过滤47、速率区离心48和甘蔗凝胶提取49。DNA折纸结构在各种缓冲液中稳定50，如果需要，储存介质可以通过自旋过滤51在PEG纯化后改变。 4. 阿加玫瑰凝胶电泳 注：使用甘草凝胶电泳可以验证折叠和去除多余丝绞线的质量。 通过在 Erlenmeyer 烧瓶中加入 1 克腺胶和 45 mL 的 1x TAE，制备 ±2%（w/v）角胶。在微波炉中加热混合物，直到甘蔗完全溶解，并产生清晰的溶液。 在自来水下冷却溶液，直到烧瓶能够舒适地触摸（50–60 °C）。 将5 mL的110 mM MgCl2和40 μL的溴化铀溶液（0.58 mgmL-1）加入溶液中，轻轻摇动混合物。注意：溴化铀是一种潜在的致癌物质，应谨慎处理。 设置凝胶铸造托盘，将液体甘蔗倒入铸造托盘。让凝胶在室温下凝固至少30分钟。 从铸造纸盒中取出凝胶并将其放入凝胶电泳室。用运行缓冲液填充腔室 （1x TAE 与 11 mM MgCl2. 每5μL样品溶液加入1μL6倍凝胶加载染料，并彻底混合。通过小心地将所需数量的样品溶液移入单独的凝胶口袋，将样品装入样品。 在95 V的恒定电压下运行角胶凝胶45分钟。将凝胶电泳室放在冰浴上，以避免凝胶受到热损伤。 使用凝胶成像系统在紫外线下可视化凝胶（图2A）。 5. 基板制备（图3A） 注： 除 SiO2增长（步骤 9）外，以下步骤都在洁净室中执行。如果此工艺不足以去除基材中的所有残留物，则还可以用基于天人鱼溶液的标准清洁步骤替代清洁步骤。 从用作基板的晶圆上切割 7 mm x 7 mm 芯片。对于 SiN，请使用硅锯、金刚石切割笔或类似机具。切割蓝宝石 （Al2O3） 需要专用工具或锯片。芯片尺寸不需要精确。 清洁芯片。 将切碎的芯片浸入热丙酮（丙酮加热至52°C）的玻璃杯中，并至少加热15分钟。根据基材的起始清洁度，可能需要较长的时间。 当它们仍在热丙酮浴中时，用棉签轻轻擦拭片，以机械方式去除任何残留薄膜。 使用钳子，从热丙酮中提起薯片，并使用洗瓶用室温丙酮冲洗。 将芯片浸入玻璃中，用异丙醇和超声波浸泡2分钟。 用钳子将芯片从异丙醇中提起，并立即使用氮流彻底干燥。只接触并握住芯片的侧面和边缘，因为钳子覆盖的区域不会正常干燥，在接触区域留下潜在的残留物和其他污染。为获得最佳效果，请使用尽可能高的流量，并保持芯片表面与流动方向平行。 将芯片存放在洁净室内的有盖容器中，以便日后使用。 6. 非晶硅层的等离子体增强化学气相沉积（PECVD） （图3B） 将芯片放入 PECVD 设备中。 设置沉积参数，以生长大约 50 nm 的无晶硅 （a-Si）。精确设置因设备型号和校准而异。有关此处使用的参数，请参阅表 3。运行 a-Si 沉积程序来增大图层。 加工后，在标准洁净室条件下将芯片存放在有盖容器中。 7. A-Si层的氧等离子体处理 （图 3B） 注：此步骤将使基板表面略带负电荷和亲水性，以便 DNA 折纸结构在以后能够借助额外的镁离子有效地吸附到表面。 将芯片放入无功式电气蚀刻 （RIE） 设备中。 设置蚀刻参数以生成氧等离子体。同样，确切的设置因设备型号和校准而异。有关此处使用的参数，请参阅表 3。运行氧气等离子体治疗方案。 继续下一步立即，因为治疗的效果将迅速恶化。通常，在血浆处理后，应在后 30 分钟内使用基板。 8. DNA折纸的沉积 （图 3C） 通过将5μL的折叠/纯化DNA折纸溶液（±20 nM）与4μL的1xFOB和1μL的1MMgCl2混合，制备DNA折纸混合物进行沉积。所得溶液含有[10 nM DNA折纸]和约100 mM Mg2+。 将DNA折纸混合物的10μL沉积在氧等离子处理芯片上，并在室温下孵育5分钟。覆盖可防止意外干燥，并有助于以后去除多余的盐和DNA折纸结构。 孵育后，通过在芯片上先移液100μL蒸馏水（例如MilliQ）来清洗表面。用移液器来回冲洗水几次，同时避免接触芯片中心。用移液器将大部分水从表面清除。这会导致只有正确吸附的折纸留在表面上。 重复此洗涤周期（步骤 8.3） 3 至 4 次。 洗涤后，立即用氮气流干燥样品。这样做的方式与基板制备中的干燥方式相同（步骤 5）。尽可能彻底地干燥样品非常重要。注：通过调整沉积溶液中DNA折纸和Mg2+的浓度，可以改变沉积结构的密度和金属纳米结构的密度。较高的Mg2+浓度可改善DNA折纸粘附，从而增加密度，但最终也会导致DNA折纸结构的聚集。因此，主要应首先调整DNA折纸浓度。 9. SiO2掩膜的生长 （图 3D） 注： 此步骤可在洁净室外执行。以下版本将生成负色调模式，但可以修改过程以生成正色调模式。SiO2的生长过程改编自Surwade等人52，作者53进一步开发，最后针对该协议进行了优化。 取一个可密封的干燥器（1.5 L），一个适合干燥器内的培养皿（可选），以及一个穿孔板，可以充当干燥器内的平台。 取100克硅胶，在培养皿中或直接在干燥器中与30克蒸馏水混合。最好至少提前24小时执行此步骤，以使硅胶稳定。注：这用于控制干燥器内的湿度，因此也用于控制 SiO2薄膜的生长速率和形态。较高的湿度会导致更高的速率和更粗糙的结构。或者，硅胶可以在气候试验室中固化。 将硅胶放在干燥器中，并将其与穿孔板分离。 将芯片与吸附DNA折纸以及打开小瓶（新鲜）10 mL的四乙基正交硅酸盐（TEOS）和另一瓶10 mL的25%氢氧化铵（NH4OH）放在干燥器，在穿孔平台上。将小瓶设置在样品的近侧和对面。最好使用烧瓶软木塞或类似的扁平底座，从平台上稍微提高芯片。注意：NH4OH 和 TEOS 在皮肤接触时都是有害的，它们的蒸汽会刺激眼睛和呼吸器官。在通风良好的区域使用，并佩戴防护手套、护目和防护服。 密封腔室并在室温下孵育20小时。这将在DNA折纸结构未定位的区域生长SiO2膜，创建一个10-20nm图案的面膜，带有DNA折纸形状的孔（图4）。 孵育后从腔室中取出样品。存放在有盖的容器中。可在此处暂停处理。处置用过的 TEOS 和 NH4OH。如果硅胶在使用间密封在干燥器内，并在2-3周内使用，则可使用2-3次。 10. SiO2和 a-Si 的活性电子蚀刻 （RIE） （图 3E） 将芯片放入无功式电气蚀刻 （RIE） 设备中。 将蚀刻参数设置为仅蚀刻 SiO2的 2-5 nm，以显示 SiO2掩膜中孔下方的 a-Si 层。必须针对单个设备进行实验确定精确设置。此处使用的参数位于表 3中。运行各向异性 SiO2等离子蚀刻程序。 设置蚀刻参数以穿透 50 nm a-Si 层。此处使用的参数再次显示在表 3中。运行各向异性 a-Si 等离子蚀刻程序。 从 RIE 设备和覆盖的存储中取出样品。可以在此处再次暂停处理。 11. 金属的物理气相沉积 （PVD） （图 3F） 将芯片加载到 PVD 仪器的蒸发室中。 选择目标金属。首先，选择粘合剂金属。在这里，使用 2 nm 的铬 （Cr）。 设置目标材料和厚度的厚度控制程序。控制方法与仪器相关。在这里，使用石英晶体微平衡（QCM）。测量的厚度由目标材料密度和 Z 因子调整，需要通过针对设备和每个目标材料的实验确定的工具因子进行校正。 启动电子束，将光束与目标对齐，并增加光束电流，直到沉积速率达到 0.05 nm/s。蒸发，直到达到2nm的最终厚度。 选择第二个目标金属（如黄金），而不通风腔室或中断工艺。中断或排气将使粘合剂金属开始氧化，并降低其作为粘合剂的可用性。 重复步骤 11.3 到 11.4。蒸发至 20 nm。这将通过总高度为 22 nm 的 SiO2掩膜孔创建 DNA 折纸形状的金属结构。 通风室并取出样品。 如果样品被覆盖，可以在此处暂停处理。 12. 氢氟酸（HF）的升空（图3G） 将 50% 基于 HF 的蚀刻液倒入合适的塑料容器中。不应将 HCl 用于混合物，因为 HCl 会在样品中蚀刻 Cr。注意：HF 具有极强的腐蚀性，会导致严重的刺激和灼伤，在皮肤接触或吸入时可能致命。仅在专用烟罩或带防护围裙、耐化学性手套和面罩的通风湿凳中使用 HF，或提供全面的化学保护。 将样品浸入基于 HF 的蚀刻剂中，用塑料钳轻轻搅拌。 等待 SiO2层完全蚀刻，金属层分离。时间会根据掩膜孔的密度而明显变化。孔数越大，蚀刻速度越快。如果金属层难以剥离，可以使用 5 到 10 s 的短暂超声。 金属薄膜分离后，用双蒸馏水和异丙醇冲洗样品。 洗水后，用氮气流干燥样品，方式与基板制备的指示相同（步骤 5）。避免钳子与芯片中心接触，因为这可能会破坏形成的纳米结构。注：样品可以在这里存储和处理暂停。 13. 剩余 a-Si 的 RIE （图 3H） 将芯片放入无功式电气蚀刻 （RIE） 设备中。 设置蚀刻参数，以彻底去除所有 50 nm 的 a-Si。参数可以与步骤 10 中相同，但可以使用稍长的蚀刻时间 （40 s） 来确保删除所有 a-Si。有关此处使用的参数，请参阅表 3。 运行各向异性 a-Si 等离子蚀刻程序，以去除剩余的 a-Si。 从 RIE 设备和覆盖的存储中取出样品。这将完成样品处理。 14. 原子力显微镜 注：原子力显微镜和扫描电子显微镜可用于监测薄膜生长和图案的成功，以及图像折叠的DNA折纸结构（图2B，C）。如果对步骤 5-13 中的处理样本进行成像，则可以跳过以下示例准备步骤。 AFM 样品制备 要对折叠的DNA折纸进行成像，请取一块云母基质的芯片。 使用粘合剂将云母芯片连接到玻璃显微镜幻灯片上。 通过在 1x FOB 中稀释 ±20 nM DNA 折纸 50 次，以约 0.4 nM 的浓度制备 10 μL DNA 折纸溶液。进行稀释是为了防止基板过度拥挤。 用弱胶带剥去云母片的顶层，以获得刚切出的带电表面。 将稀释的DNA折纸溶液沉积在刚切出的云母上，并在室温下孵育覆盖1分钟的样品。 孵育后，使用移液器用100μL蒸馏水清洗表面3-4次。这会导致只有正确吸附的折纸留在表面上。 将 100 μL 蒸馏水沉积在云母表面。 倾斜并尖锐地敲击桌子上的显微镜滑块，以分离大部分水。 重复此洗涤周期 3-4 次。 清洗后立即用氮气将样品彻底干燥。然后，该示例已准备好进行 AFM 成像。 将DNA折纸样品或加工过的芯片放入AFM中，并进行扫描。扫描尺寸为 1-10 μm，适合正确解析结构。 15. 扫描电子显微镜（SEM） 将样品放入 SEM 中。加工过的芯片可以根据需要使用（无需进一步制备样品）。 选择加速度电压。由于样品基板（Al2O3或 SiN）是绝缘体，因此使用低电压 （5-10 kV） 来降低充电效果。 扫描任何感兴趣的领域。最小化扫描时间，以减少充电，避免污染沉积。