Migrazione, chemio-attrazione, e analisi co-cultura per le cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergic

Le cellule endoteliali formano il rivestimento dei vasi sanguigni e mediano importanti funzioni che includono il mantenimento della permeabilità della parete del vaso, la regolazione del flusso sanguigno, l’aggregazione delle piastrine e la formazione di nuovi vasi sanguigni. Nel cervello, le cellule endoteliali fanno parte di una barriera emato-encefalica critica che controlla strettamente lo scambio di materiali tra il cervello e il flusso sanguigno¹. I nostri studi nell’ultimo decennio hanno identificato nuovi ruoli neurogenici delle cellule endoteliali cerebrali che hanno implicazioni significative per lo sviluppo e il comportamento del cervello^2,3,4,5. Abbiamo dimostrato che il prosencefalo embrionale del topo è vascolarizzato da due distinti sottotipi di vasi, i vasi di pial e i vasi periventricolari, che differiscono per anatomia, origine e profilo di sviluppo². Le cellule endoteliali che rivestono questi due sottotipi di vasi mostrano differenze distinte nei loro profili di espressione genica. Mentre le cellule endoteliali piale esprimono per lo più geni legati all’infiammazione e alla risposta immunitaria, le cellule endoteliali periventricolari sono arricchite in modo univoco nell’espressione di geni comunemente associati a neurogenesi, migrazione neuronale, chemiotassi e guida degli assoni³. Le cellule endoteliali periventriculari ospitano anche un nuovo percorso di segnalazione GABA che è distinto dal tradizionale percorso di segnalazione neuronale GABA⁵. Concomitante con la sua espressione genica, sono state trovate cellule endoteliali periventricolari per regolare la migrazione e la distribuzione di interneuroni GABAergici nella neocorteccia in via di sviluppo. Durante lo sviluppo embrionale, le cellule endoteliali periventriculari subiscono una migrazione a lunga distanza lungo un gradiente ventrale-dorsale per stabilire la rete vascolare periventricolare^2,3. Questa rotta migratoria si rispecchia un giorno dopo dagli interneuroni. Gli interneuroni che migrano interagiscono fisicamente con la rete vascolare periventricolare preformata e la usano come guida per raggiungere la loro destinazione finale nella neocorteccia. Oltre ad agire come substrato fisico, le cellule endoteliali periventricolari servono come fonte di segnali di navigazione per i neuroni che migrano. Guide endotiliariche GABA semeggiate da cellule interneuroni e regola i loro schemi di distribuzione finale⁴. I difetti nella migrazione e distribuzione di interneuroni sono associati a disturbi neuropsichiatrici come autismo, epilessia, schizofrenia e depressione^6,7,8,9,10. Pertanto, lo studio delle funzioni endoteliali periventricolari e la loro influenza sulla migrazione interneurone nel contesto umano diventa fondamentale per affrontare la patogenesi di questi disturbi.

Abbiamo generato cellule endoteliali periventricolari umane da cellule staminali embrionali umane nel nostro laboratorio¹¹, utilizzando la tecnologia indotta di cellule staminali pluripotenti (iPSC)^12,13. Per verificare se le cellule endoteliali periventriculari umane imitano fedelmente le cellule endoteliali periventricolari del topo e per valutare quantitativamente la loro influenza sulla migrazione interneurone, abbiamo sviluppato tre saggi in vitro: un saggio di migrazione a lunga distanza, un test di migrazione co-culturale e un’attrazione chemio-attrazione. Qui descriviamo i protocolli per questi saggi in dettaglio. Tutti e tre i saggi si basano sull’uso di inserti di coltura del silicone per creare una piccola patch rettangolare di celle (di dimensioni fisse) circondate da spazio senza celle. La distanza di migrazione viene valutata misurando la distanza tra le posizioni finali delle celle dal bordo della patch rettangolare che è stata delineata il giorno 0. Nel test sulla migrazione a lunga distanza, le cellule endoteliali periventricolari umane vengono semimate come patch al centro di un piatto di 35 mm e vengono calcolate le distanze percorse dalle cellule per un lungo intervallo di tempo. Nel saggio di migrazione co-culturale, le cellule endoteliali periventranti umane sono co-semiseme con interneuroni umani come una patch in un piatto da 35 mm. Questa configurazione consente di esaminare l’effetto delle interazioni fisiche dirette di questi due tipi di cellule sul tasso di migrazione degli interneuroni. Il saggio chemio-attrazione misura la migrazione degli interneuroni in risposta a segnali chemio-attraenti secreti dalle cellule endoteliali periventriculari umane. Gli interneuroni sono semi come una macchia rettangolare, con cellule endoteliali periventrapicolari umane e controllano le cellule endoteliali non periventriculari come cerotti di dimensioni simili su entrambi i lati. Ciascuna delle patch cellulari è separata da uno spazio privo di cellule di 500 m. La risposta degli interneuroni viene valutata quantificando il numero di cellule migrate verso cellule endoteliali periventricolari rispetto al controllo delle cellule endoteliali non periventricolari.

Questi saggi forniscono una solida valutazione delle funzioni endoteliali periventricolari umane e della loro influenza sulla migrazione degli interneuroni. La nuova configurazione del saggio a lunga distanza e della analisi della migrazione co-culturale fornisce uno spazio senza cellule nell’intervallo di centimetri (1-1,5 cm) per consentire il rilevamento della migrazione a lunga distanza. Una sintesi delle caratteristiche dei nostri saggi rispetto ad altri saggi popolari è presentata nella Tabella 1. Collettivamente, i saggi qui descritti serviranno come piattaforma per valutare le cellule endoteliali periventricolari “malattie” e gli interneuroni generati da iPSC di disturbi cerebrali come la schizofrenia, l’autismo o l’epilessia. Questi saggi possono anche essere utilizzati per determinare in che modo le diverse condizioni (ad esempio inibitori, ligando, RNAi) influenzano la migrazione cellulare. Infine, questi saggi possono essere ottimizzati per altri tipi di cellule per misurare la migrazione a lunga distanza, la chemio-attrazione o la migrazione mediata cellulare.