الفاصل الزمني التصوير الحي والقياس الكمي لديناميات فرع التقشر السريع في تطوير الخلايا العصبية Drosophila
Summary
هنا، نقوم بوصف الطريقة التي استخدمناها لتصوير فيلوبوديا الددرية المنوية في إعداد مباشر لدماغ اليرقات دروسوفيلا، والبروتوكول الذي قمنا بتطويره لتحديد مجموعات بيانات التصوير ثلاثي الأبعاد الفاصلة زمنياً للتقييمات الكمية للدندريت ديناميات في تطوير الخلايا العصبية.
Abstract
فيلبوديا الددرية المنستيرية للغاية موجودة على نطاق واسع في الخلايا العصبية في مراحل النمو المبكرة. هذه الفروع الحيوية الاستكشافية عينة البيئة المحيطة وبدء اتصالات مع الشركاء متشابك المحتملة. على الرغم من أن العلاقة بين ديناميات الفروع التقشرية ومتشابك اتّهار، إلا أن كيف أن العمليات التنموية والمعتمدة على النشاط تنظم ديناميات الفروع التقشرية غير مفهومة جيداً. ويرجع ذلك جزئيا إلى الصعوبات التقنية المرتبطة بالتصوير الحي والتحليلات الكمية لهذه الهياكل الدقيقة باستخدام نظام في الجسم الحي. أنشأنا طريقة لدراسة ديناميات dendrite باستخدام الخلايا العصبية الجانبية الجانبية النترجية اليرقات Drosophila (LNvs)، والتي يمكن أن توصف بشكل فردي باستخدام النهج الوراثية ويمكن الوصول إليها للتصوير الحي. الاستفادة من هذا النظام، وضعنا بروتوكولات لالتقاط ديناميات فرع من شجرة dendritic كله من LNv واحد المسمى من خلال التصوير الحي الفاصل الزمني. ثم قمنا بإجراء ما بعد المعالجة لتحسين جودة الصورة من خلال تصحيح الانجراف وdeconvolution، تليها تحليل ديناميات فرع على مستوى فرع واحد من خلال تحديد المواقع المكانية لجميع محطات الفروع. وأخيراً، قمنا بتطوير البرامج النصية R(الملف التكميلي)ومعلمات محددة لتحديد ديناميات الفروع باستخدام معلومات الإحداثيات التي تم إنشاؤها بواسطة تتبع المحطة الطرفية. بشكل جماعي، يسمح لنا هذا البروتوكول لتحقيق وصف كمي مفصل لديناميات فرع الشجرة التقشرية العصبية مع دقة زمنية ومكانية عالية. الأساليب التي طورناها تنطبق عموما على الخلايا العصبية قليلة المسمى في كل من المختبر وفي ظروف الجسم الحي.
Introduction
Dendrites هي مقصورات الخلايا العصبية المتخصصة التي تتلقى ومعالجة المدخلات الحسية ومتشابك. ويجري التحقيق المكثف في الهيكل المعقد والنمطي للأشجار التقشرية منذ اكتشافها. وقد تم إنشاء عدد من النظم النموذجية، بما في ذلك الخلايا العصبية الكتيكة البصرية Xenopus، وخلايا العقدة الشبكية الفرخ، والخلايا العصبية التأرّب التقشري (دا) في نظام دروسوفيلا، لدراسة تطوير وإعادة عرض واللدونة من الدنتيريات العصبية1،2،3،4. دروسوفيلا الخلايا العصبية الجانبية البطني (LNvs) هي مجموعة من الخلايا العصبية الإسقاط البصرية التي تم تحديدها في البداية لوظائفها الهامة في تنظيم circadian من السلوكيات يطير5. كما كشفت الدراسات عن دور اليرقات LNvs كهدف مباشر للمستقبلات الضوئية لليرقات (PRs)6،7. الأهم من ذلك، زراعة اليرقات النامية في أنظمة ضوء مختلفة يؤثر بقوة على حجم الأشجار الدنية LNvs ‘ ، مما يدل على ملاءمة LNvs كنموذج جديد لدراسة اللدونة الدنيستيك7. العمل الأخير من مجموعتنا يشير كذلك إلى أن كلا من حجم dendrite LNv والسلوك الديناميكي للفروع dendritic عرض اللدونة تعتمد على الخبرة8،9. كجزء من هذا العمل، قمنا بتطوير بروتوكول جديد للتصوير الحي والقياس الكمي لإجراء تحليل على ديناميات dendrite من LNvs من 2nd أو 3rd اليرقات instar.
الطبيعة الشفافة للدماغ اليرقات Drosophila يجعلها مثالية للتصوير الحي. ومع ذلك، تقع الأشجار الدنية من LNvs في اليرقات اللامعية بكثافة اليرقات العصبية البصرية (LON) في وسط فص الدماغ اليرقات6. لالتقاط صور من فروع الدندرية الدقيقة وfilopodia في أنسجة الدماغ سليمة، ونحن نستخدم اثنين من الفوتون المجهري، مما يزيد من عمق اختراق الضوء ويقلل من السمية الضوئية خلال تجارب التصوير الحي10. باستخدام هذا الإعداد، قمنا بنجاح بإجراء تجارب التصوير الحي على LNvs لأكثر من 30 دقيقة دون مراقبة التدهور المورفولوجي الواضح للخلية العصبية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التلاعبات الوراثية باستخدام تقنية الوجه تمكننا من تسمية LNvs الفردية مع غشاء الموسومة GFP، وهو أمر بالغ الأهمية أيضا لرصد تحركات الفروع الفردية11،12،13 .
لالتقاط السلوك الديناميكي لجميع الفروع على الشجرة dendritic LNv مع القرار البصري الأمثل، قمنا بإجراء التصوير 3D الفاصل الزمني على explants الدماغ اليرقات تشريح حديثا مع دقة مكانية عالية في 1 دقيقة لكل إطار لمدة 10 إلى 30 دقيقة. dendrites هي ديناميكية للغاية، مع نسبة كبيرة من الفروع عرض تغييرات يمكن ملاحظتها داخل نافذة 10 دقيقة. وهذا يؤدي إلى واحدة من التحديات التقنية الرئيسية في دراسة ديناميات dendrite، وتحديد سلوك الفرع استنادا إلى مجموعات بيانات الصورة 4D. وللأساليب المعمول بها سابقا قيود مختلفة، بما في ذلك عدم الدقة والإفراط في متطلبات الوقت. لذلك، قمنا بتطوير طريقة شبه تلقائية تجمع بين معالجة الصور اللاحقة، ووضع العلامات اليدوية على محطات الفروع، وتتبع تلقائي لبقعة 4D باستخدام برنامج تعليق توضيحي للصور. نقوم بحساب تحركات محطات الفروع في نقاط زمنية مختلفة استنادًا إلى إحداثيات الـ 3D للبقع. ثم يتم تصدير البيانات وتحليلها لإنتاج قياسات كمية لديناميات الفرع. هذا الأسلوب يقيّم بدقة مدة ومدى التمديد والتراجع الأحداث من الفروع القائمة، فضلا عن تشكيل فروع جديدة، مما يسمح لنا لمراقبة ديناميات dendrite في عدد كبير من الخلايا العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، ونحن نصف بروتوكول وضعنا لتسجيل وقياس السلوك الديناميكي للفروع dendritic في الخلايا العصبية المسماة بشكل فردي في العقول اليرقات Drosophila. وتجدر الإشارة إلى أن بروتوكول التصوير الحي لدينا يحتوي على معلمات محددة تمكننا من التقاط الشجرة الددرية الكاملة لـ LNv اليرقات وتوفير رؤية عالمية لل?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل برنامج البحوث داخل الجدارية التابع للمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية، والمعاهد الوطنية للصحة. المشروع رقم 1ZIANS003137.
Materials
| Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
| high vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
| LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
| Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
| Reagents | |||
| Glucose | |||
| HEPES | |||
| KCl | |||
| MgCl2 | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| PBS | |||
| Sucrose | |||
| TES | |||
References
- Wong, W. T., Wong, R. O. L. Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis. Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).
- Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation. The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nature Reviews Neuroscience. 11, 316 (2010).
- Cline, H., Haas, K. The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis. The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).
- Helfrich-Forster, C., et al. Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).
- Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil. Biologie du développement. 358 (1), 33-43 (2011).
- Yuan, Q., et al. Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System. Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).
- Sheng, C., et al. Experience-dependent structural plasticity targets dynamic filopodia in regulating dendrite maturation and synaptogenesis. Nature Communications. 9 (1), 3362 (2018).
- Yin, J., et al. Transcriptional Regulation of Lipophorin Receptors Supports Neuronal Adaptation to Chronic Elevations of Activity. Cell Reports. 25 (5), 1181-1192 (2018).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
- Harrison, D. A., Perrimon, N. Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila. Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).
- del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9, 47 (2011).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Niell, C. M., Smith, S. J. Live optical imaging of nervous system development. Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons. Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).
- Jacquemet, G., et al. FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387 (2017).
- Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images. BMC Systems Biology. 7 (1), 66 (2013).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Urbančič, V., et al. Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).
