JoVE Journal > Developmental Biology
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Abstract
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Biologie du développement

Quantifizierung der Selbsterneuerung in Murine Mammosphärenkulturen

Published: November 26, 2019
doi:
10.3791/60256
, , , , ,
1Department of Experimental Oncology, IEO,European Institute of Oncology IRCCS, 2Department of Oncology and Hemato-Oncology,University of Milan

Summary

Hier beschreiben wir die Umsetzung und Interpretation der Ergebnisse eines in vitro Mammosphären-Selbsterneuerungquantitativen Assays.

Abstract

Die Brustdrüse ist durch umfangreiche Regenerationsfähigkeit gekennzeichnet, da sie durch massive hormonelle Veränderungen während des gesamten Lebenszyklus eines Weibchens geht. Die Rolle von Bruststammzellen (MaSCs) wird sowohl im physiologischen/Entwicklungskontext als auch im Hinblick auf die Brustkarzinogenese umfassend untersucht. In diesem Zusammenhang sind Ex-vivo-Studien, die sich auf MaSC-Eigenschaften konzentrieren, sehr begehrt. Mammosphärenkulturen stellen einen Ersatz für die Organbildung dar und sind zu einem wertvollen Werkzeug sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die translationale Forschung geworden. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von murinen primären Mammosphärenkulturen und zur Quantifizierung von MaSC-Wachstumseigenschaften vor. Das Protokoll umfasst die Brustdrüsenentnahme und -verdauung, die Isolierung der primären Epithelzellen (MECs), die Etablierung primärer Mammosphärenkulturen, serielle Spassierung, Quantifizierung der Wachstumsparameter der Mammosphäre und interpretation der Ergebnisse. Als Beispiel stellen wir die Wirkung des konstitutiven Myktionsausdrucks auf niedrigem Niveau auf normale MECs dar, die zu einer erhöhten Selbsterneuerung und Proliferation führen.

Introduction

Isolation und In-vitro-Kultur von Brustepithelstamm- und Vorläuferzellen sind für das Verständnis ihrer Eigenschaften in der Brustzellbiologie unerlässlich geworden. Elegante Linienverfolgungs- und serielle Transplantationstests haben die Untersuchung von Stammzellen (SCs) und anderen Gewebeteilmengen im Kontext ihrer In-vivo-Nische ermöglicht. Dieser Ansatz ist jedoch zeitaufwändig und erfordert die Generierung von Reporter-Mausmodellen1,2,3,4,5. Daher ist die In-vitro-Kultur und die Vermehrung von Bruststammzellen (MaSCs) bei gleichzeitiger Erspartheit der wichtigsten Stammfähigkeitsmerkmale, nämlich Selbsterneuerung und Differenzierungsfähigkeit, eine der größten Herausforderungen auf diesem Gebiet. In den letzten Jahren wurde der Mammosphärentest weit verbreitet verwendet, um sowohl normales Brustgewebe als auch Brustkrebswachstum zu modellieren, normales oder Krebs-SCs (CSCs) zu quantifizieren und ihre Selbsterneuerungsfähigkeit als Ersatzreporter ihrer Tätigkeit in ihrem jeweiligen in vivo Kontext zu bewerten6,7,8,9,10,11.

Der Mammosphären-Assay ist ein effizienter und kostengünstiger Ansatz, bei dem frisch isolierte Brustepithelzellen (MECs) unter nicht haftenden Bedingungen kultiviert werden, mit der Prämisse, dass nur MaSCs überleben und Kugeln in Suspension bilden, während alle anderen Zelltypen durch Anoikis sterben. Darüber hinaus hängt die Fähigkeit, mehrere Generationen von Mammosphären in seriellen nicht-haftenden Passagen zu bilden, mit der Selbsterneuerungsfähigkeit der MaSCs6,9,11zusammen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll eines quantitativen Mammosphären-Assays, der ursprünglich von Dontu und Kollegen7 als Modifikation des bahnbrechenden Neurosphären-Assays12entwickelt wurde und das Wachstum vermeintlicher SCs in nicht-haftenden, serumfreien Bedingungen unter Zugabe geeigneter Wachstumsfaktoren7,12ermöglicht.

Protocol

In-vivo-Verfahren wurden gemäß der EU-Richtlinie 2010/63 und nach Genehmigung durch unsere institutionelle Ethikkommission (Organismus für das Wohlbefinden von Tieren–OPBA) und das italienische Gesundheitsministerium (IACUC-Nummern 762/2015 und 537/2017) durchgeführt. 1. Murine Brustdrüse Sammlung und Verdauung Für ein typisches Experiment opfern Sie 8-10 Wochen alte jungfräuliche weibliche Mäuse durch CO2-Inhalation. Je nach den Zielen des Experiments, verwenden Sie 5-30 Mäuse. Legen Sie die Mäuse auf Sezierbretter unter einer Haube. Verwenden Sie Nadeln, um die Vorderbeine zu dehnen und das Fell des Tieres mit Ethanol zu waschen. Heben Sie die Haut mit Dereinsundzimsen an und führen Sie einen vertikalen Schnitt aus, der auf der Ebene des Beckenbereichs beginnt und sich bis zum Gebärmutterhals bewegt, so dass das Peritoneum intakt bleibt. Um zu vermeiden, dass die Haut oder das Peritoneum zerbrechen, verwenden Sie eine runde Schere. Lösen Sie die Haut vorsichtig vom Körper mit sanften Bewegungen der Schere über die Seitenachse des Körpers. Sobald die Haut vollständig vom Brust- und Bauchbereich gelöst ist, führen Sie vier Schnitte über die vier Gliedmaßen des Tieres durch und fixieren Sie die Haut mit Nadeln. Verwenden Sie die Schere und Zange, um den Körper des Tieres vollständig von der verlängerten Haut zu lösen. Verwenden Sie die Zange, um die Brustfettpolster, die jetzt vollständig freigelegt sind, sanft zu heben und vorsichtig mit Hilfe der Schere von der Haut zu lösen. Sammeln Sie die unteren Brust- und Bauchdrüsen jeder Maus und tauchen Sie sie in Dulbeccos Phosphatgepufferte Saline (DPBS) in einem 50 ml konischen Rohr ein. Sammeln Sie bis zu 20 Drüsen pro Röhre. Halten Sie das Gewebe auf Eis.HINWEIS: Bei Bedarf können die Drüsen über Nacht auf Eis bleiben. Dies ist ein sicherer Haltepunkt. Die folgenden Schritte sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Vorbereiten und filtern Sie das Verdauungsmedium: Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) ergänzt durch 2 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin, 200 U/mL Kollagennase und 100 g/ml Hyaluronidase (siehe Tabelle der Materialien). Bis zu 20 Drüsen auf eine 100 mm Petrischale geben und das Gewebe mit einem Skalpell oder einer gekrümmten Schere zerkleinern. Vermeiden Sie die Übertragung großer Mengen von DPBS auf das Gericht. Fügen Sie 10 ml Verdauungsmedium zu jeder Petrischale hinzu und übertragen Sie das gehackte Gewebe in ein 50 ml konisches Rohr, mit einer 25 ml serologischen Pipette. Versiegeln Sie die Rohre mit Parafilm und legen Sie sie auf einen Rotator. Den Rotator mit einer niedrigen Geschwindigkeit (0,03 x g)einstellen und 2,5 h bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5%CO2inkubieren. Überprüfen Sie die Aussetzung visuell, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren. Wenn große Gewebestücke unverdaut bleiben, verlängern Sie die Inkubation bei 37 °C um weitere 30 min.HINWEIS: Alternativ kann die Verdauung über Nacht bei 37 °C, 5%CO2, mit einem sanften Kollagenase/Hyaluronidase-Enzym-Mix13durchgeführt werden. 2. Isolierung von primären murinen MECs Stoppen Sie den Rotator und entfernen Sie die Rohre aus dem Inkubator. Stellen Sie eine P1000-Spitze bei der Öffnung einer 5 ml serologischen Pipette ein. Wenn die Federung durch die P1000-Spitze verläuft, fahren Sie mit den nächsten Schritten fort. Andernfalls verlängern Sie die Inkubation bei 37 °C um weitere 30 min. Zentrifuge bei 100 x g, für 5 min bei 4 °C. Den Überstand vorsichtig dekantieren und das Pellet jedes Rohres in 3 ml DPBS wieder aufhängen.HINWEIS: Die geringe Zentrifugationsgeschwindigkeit ermöglicht die Entfernung von Lymphozyten und Fettgewebezellen. Sanfte Manipulation ist erforderlich, um zu vermeiden, dass das Pellet bei diesem Schritt abgelassen wird. Filtern Sie die Zellsuspension in jedem Rohr separat, wobei 100, 70 und 40 m Zellsiebe verwendet werden. Waschen Sie bei jedem Filterschritt die Siebe mit 2 ml DPBS, bevor Sie den Durchgang sammeln.HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt können die Zellsuspensionen gebündelt und gemeinsam verarbeitet werden. Zentrifuge bei 300 x g, für 5 min bei 4 °C. Dekantieren Sie vorsichtig den Überstand und setzen Sie die Zellen im verbleibenden Volumen von DPBS wieder auf. Fahren Sie mit der Lyse der roten Blutkörperchen (RBC) fort, indem Sie ein gleiches Volumen an Ammoniumchlorid-Kalium (ACK)-Lysepuffer hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien). Durch Pipettieren mischen und bis zu 5 min auf Eis brüten. 10 ml DPBS und Zentrifuge bei 300 x ghinzufügen, für 5 min bei 4 °C. Dekantieren Sie den Überstand sorgfältig und inspizieren Sie das Pellet visuell. Wenn das Pellet weiß ist, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Andernfalls wiederholen Sie den RBC-Lyseschritt (Schritt 2.5). Das Zellpellet in 1-5 ml Mammosphärenmedien wieder aufsetzen: Brustepithelzellwachstum Basalmedium (MEBM), ergänzt mit 2 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin, 5 g/ml Insulin, 0,5 g/ml Hydrocortison, 2% B27, 20 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 20 ng/ml Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und 0,4 I.E./ml Heparin (siehe Tabelle). 3. Serielle Mammosphere Re-Plating Zur Etablierung von Mammosphärenkulturen die Zellen auf die behandelte Nicht-Gewebekultur (ultraniedrige Adhäsion) 6-Well-Platten mit einer Dichte von 200.000 lebensfähigen Zellen/ml im Mammosphärenmedium. Inkubieren Sie die Zellen für 7-10 Tage bei 37 °C, 5%CO2. Vorbereiten und Filtern von 1% Poly-HEMA-Lösung in 95% Ethanol (siehe Materialtabelle). Mantel Ultra-Niedrige Haftung 6-Well-Platten für die folgenden Passagen, durch Zugabe von 400 l von 1% Poly-HEMA-Lösung pro Bohrgut und so dass das Ethanol vollständig trocknen. Für bessere Ergebnisse, wiederholen Sie die Beschichtung zweimal.HINWEIS: Die Verwendung von unbeschichteten Platten im ersten Durchgang ermöglicht die selektive Entfernung von Fibroblasten aus der Kultur. Am Ende der 7-10 Tage Kultur, sammeln Sie die primären Mammosphären aus allen Brunnen und Zentrifuge bei 300 x g, für 5 min bei 4 °C. Dekantieren Sie vorsichtig den Überstand und fahren Sie mit einer P200-Pipette mit gefilterten Spitzen zur mechanischen Dissoziation der Mammosphären fort. Pipette für ca. 100 Mal und visuell inspizieren die Suspension für das Vorhandensein von großen Sphäroiden.HINWEIS: Eine kurze Inkubation (2-5 min) des Kugelpellets in einem geringen Volumen (0,2-0,5 ml) Trypsin oder Accutase bei 37 °C, 5%CO2, kann verwendet werden, um die mechanische Dissoziation zu erleichtern. Bereiten Sie frische mammosphere Medium (Schritt 2.7) für die Beschichtung jeder Passage. Resuspend in 1-5 ml frisches Mammosphärenmedium und zählen Sie die lebensfähigen Zellen. Teilen Sie ggf. die Zellen in Behandlungsgruppen oder Kulturbedingungen auf. Platte 20.000 lebensfähige Zellen/ml auf poly-HEMA-beschichteten ultra-niedrigen Haftung 6-Well-Platten und inkubieren bei 37 °C, 5%CO2.HINWEIS: Mammosphären erreichen ihre maximale Größe innerhalb von 5-7 Tagen nach der Zellbeschichtung. Verteilen Sie nach Möglichkeit die Zellen jeder Probe oder Bedingung auf mehrere Brunnen, um technische Replikationen zu erhalten. Die Beschichtungsdichte sollte niedrig gehalten werden, um eine Zellaggregation zu vermeiden. Für 6-Well-Platten und 5.000 Zellen/ml für 24-Well-Platten werden maximal 20.000 Zellen/ml empfohlen. Zählen Sie nach 5-7 Tagen die Anzahl der Kugeln pro Brunnen. Dies kann entweder manuell mit einem Mikroskop mit einer 10-fachen Vergrößerungslinse oder mit digitaler Bildanalyse erfolgen (siehe Schritt 4). Sammeln Sie die Mammosphären jedes Brunnens separat und Zentrifugen bei 300 x g,für 5 min bei 4 °C. Dekantieren Sie vorsichtig den Überstand und fahren Sie mit einer P200-Pipette mit gefilterten Spitzen zur mechanischen Dissoziation der Mammosphären fort. Pipette für ca. 100 Mal und visuell inspizieren die Suspension für das Vorhandensein von großen Sphäroiden. In 1 ml frischem Mammosphärenmedium resuspendieren und die lebensfähigen Zellen zählen. Poolieren Sie die Zellen jeder Probe oder Bedingung und wiederholen Sie die Schritte 3.6-3.10. Zeichnen Sie die Anzahl der plattierten Zellen und die Anzahl der Kugeln und Zellen auf, die pro Brunnen für jede Passage gezählt werden. Fahren Sie mit Schritt 5 für die kumulative Wachstumsberechnung fort. 4. Sphere Enumeration mit digitaler Bildanalyse (DIA) Scannen Sie am Ende jeder Passage die gesamte Oberfläche aller Brunnen und erfassen Sie Bilder der Kugeln mit einer Digitalkamera, die auf einem Stereoskop montiert ist. Speichern Sie die Bilder als .tif-Dateien. Importieren Sie die Stereoskopbilder als Bildsequenz mit ImageJ14. Legen Sie die Skalierung und den Bildtyp auf 8 Bit fest. Duplizieren Sie den Stapel von Bildern, und wählen Sie Hintergrund von der Registerkarte Prozess in der Menüleiste abziehen aus. Überprüfen Sie die Optionen Licht Hintergrund und Gleiten Paraboloid und klicken Sie auf die Schaltfläche OK. Verarbeiten Sie alle Bilder des Stapels. Wählen Sie Anpassen und dann Schwellenwert aus der Registerkarte Bild der Menüleiste. Wenn Sie auf Anwendenklicken, wird ein Dialogfenster mit dem Titel Stack in Binary konvertieren angezeigt. Wählen Sie Standard als Methode und Licht als Hintergrund aus. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Schwellenwert für jedes Bild berechnen und klicken Sie auf die Schaltfläche OK. Wählen Sie sequenziell die Befehle Watershed, Open und Erode aus der Binärliste unter der Registerkarte Prozess der Menüleiste aus. Verarbeiten Sie alle Bilder des Stapels, indem Sie auf die Schaltfläche Ja des angezeigten Dialogfelds klicken.HINWEIS: Diese Prozesse ermöglichen die visuelle Segmentierung von Objekten, die berühren, Objektglättung und Entfernen von Pixeln vom Rand der Objekte. Wählen Sie die Funktion Partikel analysieren aus dem Menü Analysieren. Legen Sie den Mindestgrößenschwellenwert auf 10.000 m2 und die Zirkularität zwischen 0,50 und 1,00 fest. Wählen Sie im Dropdown-Menü Anzeigen die Option Ellipsen aus. Aktivieren Sie Zusammenfassen, An Kanten ausschließen und In situ Anzeigen und klicken Sie auf die Schaltfläche OK. Verarbeiten Sie alle Bilder des Stapels. Überprüfen Sie visuell die Entsprechung der Ellipsen mit Kugeln und korrigieren Sie bei Bedarf die Partikelzahl entsprechend. Summieren Sie die Zählungen aus allen Rahmen jedes Brunnens, um die Gesamtzahl der Mammosphären pro Brunnen zu erhalten. 5. Berechnung der kumulativen Wachstumskurve HINWEIS: Die Anzahl der Mammosphären, die in jedem Brunnen am Ende jeder Passage (PN) gezählt werden, gibt die Anzahl der Mammosphären-initiierenden Zellen wider, die am Anfang von PNausgesät wurden. Registrieren Sie für jede Passage (PN) die Anzahl der plattierten Zellen und die Anzahl der Zellen und Kugeln, die pro Brunnen gezählt werden. Berechnen Sie die Kugelgröße am Ende jeder Passage:Kugelgröße PN (Zellen / Kugel) = Zellen gezählt PN / Kugeln gezählt PNHINWEIS: Die Kugelgröße bei PN ist ein Maß für das proliferative Potenzial jeder Mammosphären-initiierenden Zelle, die bei PNgesät wird. Schließen Sie die Anzahl der vergoldeten Kugeln, indem Sie die Anzahl der für PN plattierten Zellen durch die Kugelgröße dividieren, die am Ende des vorherigen Durchgangs berechnet wurde (PN-1):Kugeln plattiert PN = Zellen plattiert PN / Kugelgröße PN-1HINWEIS: Konventionell wird die Kugelgröße während des ersten Durchgangs der Kultur als stabil angenommen (d.h. Kugelgröße P0 = Kugelgröße P1). Wenn mehrere Bohrungen als technische Replikationen verwendet werden, verwenden Sie die durchschnittliche Kugelgröße bei PN-1 als Nenner. Berechnen Sie die kumulative Zelle und Kugelzahl für jeden Brunnen pro Durchfahrt:Kumulative Zahl PN = (Anzahl PN / platt PN) X kumulative Zahl PN-1.HINWEIS: Konventionell ist die kumulative Zahl P0 = plattiert P1. Wenn mehrere Bohrungen als technische Replikationen verwendet werden, berechnen Sie die durchschnittliche kumulative Zahl pro Probe oder Bedingung für jede Passage. Zeichnen Sie die Datenpunkte auf einer halblogarithmischen Skala. Zeigt die Durchgangszahl (P0 bis PN) auf der x-Achse (lineare Skala) und die kumulative Zelle oder Kugelzahl auf der y-Achse (logarithmische Skala) an. Passen Sie eine exponentielle Trendlinie an die Datenpunkte an und berechnen Sie den Bestimmungskoeffizienten (R2), um die Güte der Passung zu messen.HINWEIS: Die an die Datenpunkte angepasste Trendlinie sollte eine exponentielle Kurve annähern, wie erwartet für eine Zellpopulation, die mit einer konstanten Rate wächst oder stirbt. R2 nimmt Werte zwischen 0 und 1 an, wobei Werte, die am nächsten 1 sind, eine bessere Anpassung anzeigen. Stellen Sie die Gleichung der Trendlinie als natürliche exponentielle Funktion dar, um die Wachstumsrate (GR) der Kultur abzuleiten:y = y0 e(GR)x, wobei y0 der Wert von y ist, wenn x = 0.

Representative Results

Myc-Überexpression in normalen MECs, führt zu einer erhöhten Häufigkeit von Mammosphären-Initiierungszellen. Dies wird durch einen doppelten Mechanismus erreicht: Myc erhöht die Rate der symmetrischen MaSC-Divisionen und die Häufigkeit der Neuprogrammierung von Vorläufern in neue MaSCs11. Um die Wirkung einer niedrigen konstitutiven Myktion zu testen, verwendeten wir das transgene Mausmodell Rosa26-MycER, bei dem die Myktion durch 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)15induziert werden kann. Wir haben zuerst die MECs auf ultra-niedrige Haftung 6-Well-Platten plattiert, um Fibroblasten zu entfernen, in Ermangelung von 4-OHT. Nach dem ersten Durchgang teilten wir die Kultur in zwei Teile auf: Zwei Brunnen wurden unbehandelt (Kontrolle) und zwei Brunnen mit 200 nM 4-OHT (MycER) behandelt. Wir haben die Kugel- und Zellzahlen von 5 aufeinanderfolgenden Passagen für drei unabhängige Experimente gezählt (Tabelle 1). Die kumulativen Zellen- und Kugelzahlen pro Durchfahrt sind in Tabelle 2dargestellt. Die Induktion mit 4-OHT führt zu erhöhten Kugel- und Zellwachstumsraten, wie in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 1: Repräsentative Ergebnisse. Kumulative Kugel (A) und Zelle (B) Wachstumskurven von Steuerung und MycER-Mammosphären. Mittelwert und Standardabweichung von 3 unabhängigen Experimenten werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 1. Beschichtung 2. Beschichtung 3. Beschichtung 4. Beschichtung 5. Beschichtung Zellen plattiert Zellenanzahl Kugelanzahl Zellen plattiert Zellenanzahl Kugelanzahl Zellen plattiert Zellenanzahl Kugelanzahl Zellen plattiert Zellenanzahl Kugelanzahl Zellen plattiert Zellenanzahl Kugelanzahl Exp1 Steuerung 77,000 50,000 31 65,000 58,500 41 57,000 30,000 32 30,000 22,000 5 22,000 0 0 77,000 81,000 41 65,000 55,000 23 MycER 77,000 31,0000 193 80,000 375,000 323 80,000 380,000 217 80,000 220,000 223 80,000 170,000 155 77,000 110,000 142 80,000 505,000 396 80,000 270,000 149 80,000 290,000 194 80,000 250,000 160 Exp2 Steuerung 75,000 75,000 71 60,000 17,000 34 28,000 45,000 29 45,000 13,000 2 13,000 0 0 75,000 47,000 45 60,000 11,000 47 MycER 75,000 200,000 188 80,000 225,000 277 80,000 230,000 155 80,000 210,000 211 80,000 100,000 95 75,000 250,000 192 80,000 202,500 283 80,000 305,000 185 80,000 160,000 237 80,000 100,000 133 Exp3 Steuerung 82,500 130,000 121 80,000 45,000 105 80,000 110,000 86 80,000 58,500 75 58,500 58,500 78 82,500 125,000 177 80,000 71,250 42 MycER 82,500 325,000 457 80,000 610,000 327 80,000 367,000 309 80,000 500,000 260 80,000 115,000 146 82,500 475,000 463 80,000 455,000 392 80,000 415,000 204 80,000 470,000 295 80,000 185,000 161 Tabelle 1: Anzahl der gezählten Kugeln und Anzahl der zellen, die an jedem Durchgang plattiert und gezählt werden. Tabelle 2: Berechnung der plattierten Kugelzahlen und der kumulativen Kugel- und Zellzahlen. Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)

Discussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur quantitativen Beschreibung der MaSC-Wachstumseigenschaften in vitro. Als Beispiel stellen wir die Wirkung der konstitutiven Myktion auf niedrigem Niveau auf normale murine MaSCs dar. Dieser Ansatz kann jedoch gleichermaßen auf verschiedene Kontexte angewendet werden. Menschliche oder murine Primärzellen sowie etablierte Zelllinien können unter verankerungsunabhängigen Bedingungen kultiviert werden, um Mammosphärenkulturen zu etablieren, die seriell durchgehen können. Genüberexpression und RNA-Interferenz können leicht in das Protokoll mit dem Zusatz eines viralen Transduktionsschritts am Ende des ersten Durchgangs (nach Schritt 3.5) eingeführt werden. Alternativ können Zellen in der Haftung infiziert und dann als Mammosphären plattiert werden.

Ein kritischer Aspekt des hier vorgestellten Assays ist die Saatzelldichte, die niedrig genug sein sollte, um die Erzeugung von Aggregaten zu vermeiden, die die Interpretation der Ergebnisse16,17stören. Die Morphologie der Mammosphären kann informativ sein, um diese Mehrdeutigkeit zu lösen. Nur kompakte, runde Kugeln sollten am Ende jeder Passage aufgezählt werden. Sowohl die Zirkularität der Sphäroide als auch die Größe sollten berücksichtigt werden. Mit dem automatisierten Prozess der DIA wird dieser Schritt mit den entsprechenden Schwellenwerten objektiv und absolut sichergestellt. Oft bilden Vorläufer-Strukturen oder kleinere Zellhaufen, die von der Mammosphäre ausgeschlossen werden sollten. Als Faustregel verwenden wir einen Schwellenwert von 100 m Durchmesser. Schließlich sollte darauf geachtet werden, dass intakte oder nicht vollständig voneinander dissoziierte Mammopshere von einem Durchgang zum nächsten übertragen werden. Auf der anderen Seite führt übermäßiges Pipettieren zu einem erhöhten Zelltod. Wenn solche Schwierigkeiten auftreten, empfehlen wir daher, eine milde Trypsinisierung oder Accutase-Behandlung zu verwenden und die dissoziierten Kugeln durch ein 40-m-Sieb zu übergeben, um die Erzeugung von einzelligen Suspensionen zu gewährleisten.

Die Kugelbildungseffizienz (SFE) wurde alternativ als Ersatz für SC- oder CSC-Quantitation ex vivo in Mammosphärenkulturen eingesetzt. SFE ist in der Tat ein Maß für stammzellenähnliche Zellen in einer bestimmten Zellpopulation. Sie stellt jedoch einen weniger gewissenhaften Ansatz dar, da er Informationen nur zu unterschiedlichen Zeitpunkten bereitstellt. Die Berechnung der kumulativen Kugelzahlen und die Erzeugung von kumulativen Wachstumskurven hingegen ermöglicht den Rückschluss der Wachstumsrate der Kultur vom anfänglichen Zellaussaatschritt bis zur Ausschöpfung der Kultur oder, im Falle verewigter Kulturen, für die gewünschte Anzahl von Passagen. Die Bewertung der Wachstumseigenschaften ermöglicht die Bewertung der Abweichung vom exponentiellen Wachstum durch den KoeffizientenR2 und in einem zweiten Schritt die Bewertung des GR-Wertes selbst.

Wichtig ist, dass kumulative Mammosphärenwachstumskurven verwendet werden können, um die Wirkung von kleinen Molekülinhibitoren oder anderen Chemotherapeutika selektiv auf der CSC-Ebene6,11zu bewerten. Im Gegensatz zu normalen primären Mammosphären, die in 5-7 Passagen funktionell ausschöpfen, dehnen sich Tumormammosphären tendenziell unbegrenzt aus. Diese Funktion ist mit der unbegrenzten CSC-Selbsterneuerungsfähigkeit verknüpft. Die Auswirkungen auf proliferation und CSC-Selbsterneuerung können durch die Erzeugung von Tumorzell- bzw. Mammosphärenwachstumskurven entkoppelt werden. Es wird erwartet, dass ein CSC-spezifischer Effekt zu einer Abnahme der kumulativen Mammosphärenwachstumsrate mit oder ohne Auswirkungen auf die kumulative Zellwachstumsrate6,11führen wird.

Ein weiterer Bereich, der von Interesse ist, ist der Bereich der Umprogrammierung des Erwachsenengewebes SC. Ausgewachsene Mammosphären bestehen aus einer phänotypisch heterogenen Zellpopulation, in der nur eine kleine Fraktion stammartige Merkmale behält, einschließlich der Mammosphären-initiierenden Fähigkeit und der Regeneration der Brustdrüse bei der Transplantation in vivo6,9,11,18,19. Brustvorläufer können so entweder mit in vitro etikettenerhaltenden Assays6,9,11 oder ex vivo mit etablierten Oberflächenmarkern2,3isoliert werden. Bemerkenswert ist, dass Brustvorläufer Anoikis nicht überleben und nicht in der Lage sind, Mammosphären zu bilden. Es hat sich gezeigt, dass erzwungene Myktionsexpression Mammosphären-Initiationspotenzial für Brustvorläufer verleiht, die als PKHneg11isoliert sind, was zur Erzeugung einer Kultur führt, die auf unbestimmte Zeit durchdrungen werden kann. In ähnlicher Weise können Interferenzen negativer Regulatoren der physiologischen Reprogrammierung mit dem gleichen Test getestet werden. In diesem Zusammenhang kann ein häufiges Problem auftreten, die begrenzte Anzahl von Zelleneingaben. Wenn der Zelleingang weniger als 10.000 Zellen ist, empfehlen wir die Aussaat in 24-Well-Platten (maximal 5.000 lebensfähige Zellen/ml). Dennoch können sich die bedingungen für eine unabhängige Kernkultur als zu hart erweisen, um eine Neuprogrammierung zu erzielen, insbesondere in Fällen, in denen der Umprogrammierungseffekt nicht unmittelbar ist. In solchen Fällen könnte die Verwendung einer unterstützenden Matrix und dreidimensionaler organoider Kulturen besser geeignet sein20.

Insgesamt ist der Mammosphären-Assay eine kostengünstige Option, die leicht für die Bewertung von stammähnlichen Eigenschaften in normalen und tumoralen MEC-Populationen verwendet werden kann. Der in diesem Protokoll verwendete quantitative Ansatz erleichtert die Vergleiche zwischen Kulturen, die unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt oder unterschiedlichen Reizen ausgesetzt sind. Wenn es rigoros befolgt wird, bietet es ein relativ einfaches Ex-vivo-Modellsystem, das die Entkopplung der verschiedenen Akteure ermöglicht, die Stammeigenschaften in vivo definieren, was die Möglichkeit detaillierterer mechanistischer Studien bietet.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Bruno Amati für das freundliche Geschenk des transgenen Mausmodells Rosa26-MycER. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von WWCR, AIRC, ERC und dem italienischen Gesundheitsministerium an P.G.P. T.V. und X.A. finanziert, die von FIRC und A.S. durch ein FUV-Stipendium unterstützt wurden.

Materials

ACK lysis buffer Lonza 10-548E Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL.
B27 Invitrogen 17504-044 B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v.
bFGF Peprotech 100-18B Human recombinant fibroblast growth factor – basic, 50 μg. Stock solution 100 μg/μL in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v.
Collagenase Sigma C2674 Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v.
DMEM Lonza 12-614F Dulbecco's modified Eagle's medium
DPBS Microgem S17859L0615 Dulbecco's phosphate buffered saline
EGF Tebu-Bio AF-100-15 Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 μg/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v.
Glutamine Lonza 17-605E L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v.
Heparin PharmaTex 34692032 Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v.
Hyaluronidase Sigma H4272 Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v.
Hydrocortisone Sigma H0888 Stock concentration 100 μg/mL. Final dilution 0.5% v/v.
Insulin SAFCBiosciences 91077C Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v.
Low attachment 6-well plates Corning 351146 Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid.
MEBM Lonza CC-3151 Mammary epithelial cell growth basal medium
Penicllin-Streptomycin mixture Lonza 17-602F Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 µg streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v.
Poly-HEMA Sigma P3932 Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 °C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 μm) before use.
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References

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Mammosphere CultureSelf-renewalBreast Stem CellsQuantificationCell CultureCell IsolationCell CountingCell LysisUltra-low AdhesionPrimary Mammosphere Formation

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Citer Cet Article
Vlachou, T., Aobuli, X., D’Elia, E., Santoro, A., Moroni, M. C., Pelicci, P. G. Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures. J. Vis. Exp. (153), e60256, doi:10.3791/60256 (2019).
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