提出了一种利用X射线特异性染色方法对微观组织结构进行三维可视化的协议,该方法专为X射线计算机断层扫描而设计。
我们演示了一种基于实验室的方法,将X射线微CT和纳米CT与特定的X射线染色相结合,以细胞质为目标。所述方案易于应用,速度快,适用于较大的软组织样品。所呈现的方法能够对关键的组织结构进行三维的表征,并在整个小鼠肾脏上进行演示。多尺度方法允许图像整个小鼠肾脏,并支持选择更多感兴趣的体积,这些兴趣的获取分辨率更高,范围可达纳米范围。因此,复制具有与相应组织学光显微镜图像相似细节级别的软组织形态。在不妨碍通过组织学方法进行进一步调查的情况下,可以深入了解组织结构的 3D 配置。
软组织标本的完整表征需要有关3D组织微观结构的信息。目前软组织样本分析的黄金标准是组织病理学。使用光学显微镜1在选定感兴趣的区域(ROIs)中以2D方式探索标本的组织和细胞形态。但是,此方法有几个缺点。样品的制备非常耗时、复杂、具有破坏性,而且容易出现伪影。生成的显微幻灯片仅提供与切片平面平行的 2D 信息。通常,由于时间限制2,3,调查组织学部分的数量受到限制。
近年来,3D生物学领域不断发展。在这里,可从任何所需空间平面访问虚拟组织切片。这允许在整个样本中跟踪结构,从而更深入地了解与不同病理相关的 3D 组织架构和结构变化。已经开发出各种方法来生成 3D 体积数据。它们范围从基于序列截面的方法,使用光或电子显微镜4,5,6,7,8,到块面成像方法,如表观3D成像或块面扫描电子显微镜7,8,9。然而,上述所有方法都涉及对样品进行分割或完全销毁,这不允许进一步调查。获得分辨率高度依赖于切片过程容易产生传统方法学中所述的伪影。这些方法还受到对齐伪影的影响。
3D X 射线成像技术,如显微和纳米计算机断层扫描(微CT 和纳米CT),渴望在不破坏组织样本的情况下生成 3D 高分辨率数据。到目前为止,软组织的弱X射线衰减对比度和实验室环境中对高分辨率的获取有限,已影响其用于微观组织结构的3D可视化。最近向基于实验室的高分辨率X射线CT迈进,使分辨率远低于1μm 10、11、12、13。
传统衰减X射线成像中软组织缺乏对比度,通过染色剂得到补偿,从而增强X射线衰减对比度。从其他成像技术(如四氧化二氮(OsO4)、碘化钾(IKI)或磷酸(PTA)中已知的染色剂,经常使用14、15、16、17 18,19,20,21,22,23,24,25。允许 (i) 特定生物靶向的染色剂,(ii) 同质和完全染色,(iii) 易于处理,(iv) 快速渗透组织而不产生扩散环等伪影,(v) 大而致密的组织染色,以及 (vi)建立X射线CT作为微观组织结构的3D可视化工具,需要与组织病理学完全兼容。在本作品中,我们展示了如何为X射线CT成像制备软组织样本,并基于符合上述要求的eosin的细胞质特异性X射线染色。
多尺度成像方法通过概述微CT测量和选择感兴趣的体积(VOI)进行进一步的高分辨率调查,确保对染色质量的评估。对染色质量进行分析的重点是染色参数,如(i) 完整性、(ii) 扩散环的外观、(iii) 对比度增强、(iv) CT 伪影(如条纹)的外观和 (v) 同质性。基于实验室的纳米CT设置,使用几何放大率达到分辨率到100nm,可视化软组织形态在(子)细胞水平10,27。对纳米CT切片与相应的组织学光显微镜图像的比较分析,确认在2D的微观水平上具有相似细节的组织结构的复制,从而能够对组织进行组织病理学特征化样品。这个详细的视频协议旨在提高认识,并突出这种方法作为无损3D软组织成像工具的潜力,为广泛的科学界,如动物学家,生物学家和健康感兴趣专业 人士。
目前,eosin被用作标准组织学协议,为细胞质贴上标签。染色剂作为0.1%(w/v)水溶液应用于软组织的微小切片(一般切割厚度为2-10μm)33。这种标准化组织学协议应用于3D组织样本,如整个小鼠肾脏,不会导致衰减对比度增强CT图像。一方面,这可归因于实验室微CT系统通常使用的X射线能量的软组织低内在衰减特性。通常,软组织主要由碳、氢、氧和氮34组成,因此不会导致对比度的增强。另一方面,用于染色的eosin浓度低是限制因素。即使一个eosin分子包含四个溴化物原子(高原子元素溴与Z = 3534),X射线CT成像所需的灵敏度水平没有达到。
为了克服低衰减对比度的挑战,研究了几种浓度的eosin。这里的限制是水中eosin的最大溶解度,在水溶液中为30%(w/v)。根据兰伯特-比尔定律,在软组织内观察到最佳衰减对比度增强,其浓度最高,这是预期的。因此,最终的染色方案是在最高浓度下进行的。
pH调整回答了如何在分子水平上为染色程序最佳制备软组织以进一步提高对比度的问题。在这里,在固定期间或染色之前,软组织样品的酸化是至关重要的。洪等人也证明了这一点。通过改善离子相互作用,使细胞细胞质中染色剂在细胞细胞质中的积累更高,这是细胞细胞质中蛋白质和肽的氨基酸侧链的原型作用的结果。与未染色的软组织样本相比,具有代表性的结果强调了对比度增强,如图 1 a,b所示。在这里,整个小鼠肾脏的结构概述可视化的关键解剖区域,如皮层,髓母,辣椒和肾骨盆。
提出的染色协议应用简单,仅包含三个步骤。所需的试剂易于访问。整个器官染色的总染色时间为 24 小时,使软组织样本(图 1 c、图 2 b 和图 4 b)在实验室环境中实现 3D 可视化(图 1c、图 2b和图 4b)多个比例下降到蜂窝水平。需要注意的是,所需的染色溶液的总染色时间和体积可能需要根据样品的性质进行一些调整。然而,基于eosin的染色方案适用于全器官染色,从而能够对整个器官进行高分辨率的微CT成像。在微CT测量过程中,由于溶剂乙醇而用于保持样品湿润的收缩伪影没有观察到。纳米CT成像需要额外的制备步骤,这允许对从原始样品中检索到的较小组织片段进行调查。对于未来的组织病理学应用,概览扫描将提供对改变的解剖区域和结构的宝贵见解,从而能够确定 ROI,如图2a所示。这些可以通过微CT(图1c和图2b)或纳米CT(图4b)在3D中进行研究,并在2D中用组织学(图3)进行评估。
该协议的另一个优势在于与组织病理学在H&E染色程序方面的完全兼容。在散装样品上应用基于eosin的染色程序并不妨碍进一步组织学研究(图3),即使应用的eosin浓度比组织染色溶液高得多。虚拟厚度约为400nm的纳米CT切片(图3a)与组织学部分(图3c)相比已经非常充分,后者来自相应的软组织样本。考虑到具有 7-10 μm 的组织学部分的近似厚度,纳米CT数据(图 3 b )的最小强度投影切片的生成(图 3b),对应于大约 7 μm 的虚拟厚度,从而允许更好地与组织学部分进行比较 (图 3c)。在这里,细胞核被清楚地揭示为非衰减区,因为eosin特别染色细胞质33中的蛋白质和肽。
与标准组织染色程序相比,污渍顺序被颠倒了,但采用标准组织学方法进一步反染色是有可能的。首先从开发的基于eosin的CT染色方案开始,然后对这些基于eosin的基于血氧素的表氧化素进行反染色,允许完全兼容,并产生显示预期形式的高质量染色的外观。用迈尔的酸血氧素对细胞核进行特异性染色应用于组织学部分,以紫色突出细胞核(图3d)。组织学计数器染色的应用目前仅限于H染色。其他标准组织学计数器染色,如周期性酸希夫的基础,弹性范吉森或戈莫里银必须进行评估,以及与免疫组织学技术的兼容性需要测试。
基于eosin的染色协议允许(i)细胞细胞质特异性靶向,(ii)均质和完全染色,(iii)易于实现,(iv)快速穿透组织而不产生扩散环等伪影,(v)染色大而致密的软组织样本,以及(vi)与H&E染色方面的组织病理学完全相容。这些要求对于允许将软组织进行高分辨率 X 射线 CT 可视化到细胞水平非常重要。结合最近开发的纳米CT器件12,36,37,无损生成虚拟组织学切片,在对比度和分辨率上与传统组织学数据相媲美可以呈现。这种组合方法将使X射线CT成为微观组织结构的3D可视化的宝贵工具。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢恩肯·德雷科尔博士在瑞典Excillum AB进行组织学讨论和非常有帮助的团队。我们通过 DFG 卓越慕尼黑高级光子学中心 (MAP) 和 DFG 戈特弗里德·威廉·莱布尼茨计划获得财政支持。此外,该研究项目还获得了欧盟地平线2020年研究与创新项目根据玛丽·斯科多夫斯卡-库里赠款协议No.H2020-MSCA-IF-2015-703745-CONSALT。
50-ml centrifuge tube by Falcon | VWR | 734-0453 | |
Formaldehyde solution, 37% | Carl Roth | CP10.2 | acid-free, stabilized with ~10% MeOH |
Glacial acetic acid | Alfa Aesar | 36289.AP | |
Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | certified by Biological Stain Commission |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium |
Sample Tubes by Nalgene | Carl Roth | ATK5.1 | |
Rocking Shaker ST5 | CAT | 60281-0000 | |
Cellulose tissue paper | VWR | 115-0600 | |
Forceps, by USBECK Laborgeräte | VWR | 232-0096 | |
Microcentrifuge tubes by Eppendorf | VWR | 211-2120 | safe-lock, 2.0 ml |
Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
Disposable safety scalpel by Aesculap | VWR | AESCBA210 | |
Petri dish by Sterilin | VWR | 391-2019 | |
Plastic pasteur pipette | Carl Roth | EA68.1 | graduated, 1 ml |
Desiccator by Duran | VWR | SCOT247826954 | |
Silicone grease by Bayer | Sigma-Aldrich | 85404 | high-vacuum |
Carbon dioxide cylinder with standpipe | Linde | 3700113 | 10 kg, short |
micro-porous treatment capsule | PLANO GmbH | 4614 | pore size 78 µm (B) |
Bal-Tec CPD 030 | Bal-Tec AG | CO2 as drying agent | |
Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCD | Zeiss | this stereomicroscope has been updated(1) | |
Zeiss Xradia Versa 500 | Zeiss | this microCT scanner has been updated(2) | |
Avizo Fire 8.1 | Thermo Fisher Scientific | ||
PILATUS detector as part of the nanoCT scanner | Dectris | single-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7) | |
nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scanner | Excillum | high-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7) | |
(1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019). | |||
(2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019). | |||
(3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015). | |||
(4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009). | |||
(5) Kraft, P. et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009). | |||
(6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019). | |||
(7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019). |