Оптическое изображение изолированных морин желудочковых миоцитов

Все методы и процедуры, описанные в этом протоколе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Университета Кейс Вестерн Резерв. 1. Подготовка решений, инструментов и обложк ПРИМЕЧАНИЕ: 1x решения могут быть использованы в течение месяца. Сделать 10x Кребс-Хенселейт буфер HEPES буфер без кальция (KHB-HB) путем добавления 68,96 г NaCl, 3,57 г KCl, 59,58 г HEPES, 2,18 г K2HPO4, 3,08 г MgSO4 и 19,82 г глюкозы до 800 мл двойной дистиллированной воды в колбе 1000 мл. После полного растворения содержимого довести до объема в объемной колбе объемом 1000 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Традиционный раствор Krebs Henseleit использует бикарбонат натрия в качестве буфера, и в растворе в этом протоколе используется раствор Krebs Henseleit с буфером HEPES. Решение стабильно в течение 6 месяцев, если стерильный фильтр. Сделать 10x Tyrode решение, добавив 86,51 г NaCl, 0,552 г2PO4, 2,03 г MgCl2, 9,91 г глюкозы, 4,03 г KCl, 2,65 г CaCl2, и 35,76 г HEPES до 800 мл двойной дистиллированной воды в fl0. После того, как содержимое полностью растворится, довести до объема в 1000 мл объемной колбы.ПРИМЕЧАНИЕ: Решение стабильно в течение 6 месяцев, если стерильный фильтр. Сделайте 1x KHB-HB, измеряя 100 мл 10x запасов и добавляя к 875 мл двойной дистиллированной воды в колбе 1000 мл. Поместите колбу в водяную ванну 37 градусов по Цельсию. После того, как раствор достиг 37 градусов по Цельсию, используйте NaOH, чтобы увеличить рН до 7,39. После регулировки рН доведите раствор до объема в объемной колбе объемом 1000 мл. Стерильный фильтр раствор с помощью системы фильтрации вакуума. Сделайте раствор 1x Tyrode, измерив 100 мл 10-x запаса и добавив к 875 мл двойной дистиллированной воды в колбе 1000 мл. Поместите колбу в водяную ванну 37 градусов по Цельсию. После того, как раствор достиг 37 градусов по Цельсию, используйте NaOH, чтобы увеличить рН до 7,39. После регулировки рН доведите раствор до объема в объемной колбе объемом 1000 мл. Стерильный фильтр с использованием системы вакуумной фильтрации. Сделайте 1x модифицированный раствор Tyrode, измеряя 100 мл 10x запаса и добавляя к 875 мл двойной дистиллированной воды в колбе 1000 мл. Растворите 3,07 г L-глутатиона, уменьшенного в колбе. Поместите колбу в водяную ванну 37 градусов по Цельсию. После того, как раствор достиг 37 градусов по Цельсию, используйте NaOH, чтобы увеличить рН до 7,39. После регулировки рН доведите раствор до объема в объемной колбе объемом 1000 мл. Стерильный фильтр раствор с помощью системы фильтрации вакуума. Сделать 100 мМ блеббистатина бульонного раствора, добавив 855 л диметилсульксида (DMSO) до 25 мг порошка. Aliquot в 20 мл шагом и хранить в морозильной камере -80 градусов по Цельсию в течение шести месяцев. Сделайте остановку буфера, добавив 2 г бычьего сыворотки альбумина (BSA) и 1 флакон алицитидного гербистатина до 100 мл 1x KHB-HB и стерильный фильтруйте раствор с помощью вакуумной системы фильтрации. Сделайте буфер покрытия, добавив 5 мл сыворотки крупного рогатого скота и 1 флакон аликотируемого запаса блеббистатина до 95 мл M199 HEPES. Стерильный фильтр раствор с помощью системы фильтрации вакуума. Сделайте буфер культуры миоцитов, добавив один 1 флакон аликота из алибистатина и 4 мл пенициллина-стрептомицина до 396 мл M199 (25 мм HEPES). Стерильный фильтр раствор с помощью системы фильтрации вакуума. Autoclave 2 пары Дюмон пинцет, 2 пары Iris изогнутые ножницы, 2 hemostats, одна пара пластической хирургии щипцы, 6 черных плетеных шелка 4-0 швы расположены для использования в качестве хирургического двойного броска узел, и четыре 100 мл клюв. Стерилизовать 22 х 22 мм2 стеклянные крышки. Во-первых, поместите один coverslip в каждом колодце из шести хорошо пластины. После этого, с снятой крышкой, включите ультрафиолетовую лампу шкафа биобезопасности и выставят крышки на ультрафиолетовый свет на 1 ч. Сделать рабочий раствор бульона ламинина путем первого оттаивания бутылки на льду. Добавьте содержимое одной бутылки к достаточно холодному стерильному фосфатно-буферизированному солину (PBS), чтобы достичь конечной концентрации 0,04 мг/мл. Aliquot из 1,3 л в автоклавированных 1,5 мл центрифуговых труб. Хранить при -80 градусах по Цельсию.ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая трубка имеет достаточно ламинина для одной шести хорошо пластины. Избегайте нескольких циклов замораживания оттепели. Пальто стерилизовано, предварительно оттаивая рабочий раствор ламинина на льду. Используя пипетку P1000, аспир 200 л ламинина. Аккуратно перетащите кончик пипетки вдоль одного края крышки, чтобы капиллярное действие, чтобы вытащить мизерное количество ламинина, чтобы облегчить крепление крышки к шести скважинам. Затем выгоните оставшийся ламинин в центре крышки. Круговыми движениями разложите капли ламинина по всему обложению. Поместите в инкубатор 37 градусов по Цельсию не менее 1 ч и до 24 ч до изоляции. 2. Подготовка аппаратура Лангендорфа ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельные компоненты аппарата Langendorff, используемые в этом протоколе, перечислены в таблице материалов. Включите циркулирующую водяную ванну. Установите температуру так, чтобы перфусат имеет температуру 37 градусов по Цельсию.ПРИМЕЧАНИЕ: С раствором резервуаров, установленных на высоту 60 см, циркулирующих вод должен быть установлен до 41 градусов по Цельсию, чтобы перфусат быть 37 градусов по Цельсию. В отличие от ранее заявленных протоколов, высота резервуара не нуждается в изменении. Промыть аппарат Langendorff с 70% этанола следуют две полоскания с автоклавированной двойной дистиллированной воды. После промывоки заполните резервуар KHB-HB и оксигенизите 100% кислородом. Премьер системы, позволяя кислородом KHB-HB первый поток в 100 мл стакан. После того, как 50 мл раствора втеке в стакан, переключите 3-путь стоп-кок позиции, чтобы остановить поток из резервуара KHB-HB. Налейте 50 мл кислородом KHB-HB из стакана в коллагеназный резервуар. Пусть KHB-HB стекает из резервуара пищеварения до тех пор, пока 5 мл остается в коллагенерезервуаре. В то время как грунтовка коллагенеза резервуара, переключить 3-путь остановить петух неоднократно между резервуарами, чтобы линии дегазования. После того, как система загрунтована, не забудьте использовать дегазинговую ловушку, расположенную на верхней части нагревательной катушки, чтобы позволить любому оставшемуся воздуху выйти из системы. Сделать коллагенеза решение. Для крыс сочетают 100 мг коллагеназы II типа, 100 мл кислородом KHB-HB и 2 флакона из бульона блеббистаин. Для мышей, объединить 100 мг коллагенеза типа II, 40 мл кислорода KHB-HB, и 2 флакона из blebbistain фонда. После смешивания раствор должен быть стабильным в течение 1 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Миоцит жизнеспособность может варьироваться между типа II коллагенеза много. Воспользуйтесь программой отбора проб коллагеназа, чтобы проверить много перед оптовым заказом. 3. Изоляция миоцитов Введите животное с 1000 U гепарина. Подождите 5 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши и крысы любого возраста могут быть использованы. Однако, в целом старше или более больной животное, тем ниже выход миоцитов. Пожертвуйте животным, сначала обезболив его изофлюраном с помощью метода open-drop (1 см изиофруран на 500 куб.см объема) перед эвтанизацией животного пентобарбитальной смесью (150 мг/кг интраперитонеальной). Быстро акциз сердца, сначала захватмех меха выше процесса xiphoid. С ножницами радужной оболочки, сделать небольшой разрез непосредственно под процессxiphoid и потяните мех вверх к голове подвергая кожу. Захватите процесс xiphoid и вырезать диафрагмы подвергая грудной полости. Сделайте разрез люка, потяните грудину назад с помощью гемостата, и используйте изогнутые щипцы, чтобы вырезать сердце над восходящей аортой и поместить в холодный KHB-HB. Каннулять сердце с помощью стерео микроскопа и номер 5 щип. Убедитесь, что сердце погружено в воду и канюля была загрунтована до иссечения сердца, чтобы предотвратить эмболии. Подтвердите правильное позиционирование канюли, визуализируя кончик канюли примерно на 1 мм выше вставки аорты в желудочек.ПРИМЕЧАНИЕ: Чем быстрее время консервации, тем лучше выход миоцитов. Начните поток KHB-HB, вращая стоп-кок на Langendorff. Соедините канюлу с Лангендорфом. Пронизыруй сердце в течение 5 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку перфузия поставляется системой на основе гравитации, поток через сердце будет функцией соответствия коронарных артерий. Переключите перфузию из резервуара KHB-HB в резервуар буфера пищеварения. Как только буфер пищеварения достигает сердца, установите таймер (5 мин для мыши или 15 мин для крыс). Убедитесь в том, чтобы собрать перфусат в стерильных 100 мл стакана. Пополнить резервуар буфера пищеварения по мере необходимости с перфузатом, пока время пищеварения истекло. После пищеварения отделите камеры сердца щипками и ножницами радужной оболочки глаза в стерильных 100 мл стакана. Поместите каждую камеру в отдельный колодец из шести колодцев. Налейте 5 мл раствора коллагеназы в каждый колодец. Немедленно начните смягчать сердечную ткань ножницами. Ткань куски должны быть примерно 1 мм3. Используя стерильные переносные пипетки, аккуратно стригните фарш ткани сердца. Решение должно стать облачным. После того, как куски ткани становятся белыми и пернатыми, изучить клетки с помощью перевернутого микроскопа. Если количество жизнеспособных клеток превышает 80%, приступаем к деформации клеток в коническую трубку 50 мл с помощью 100 мкм-ситечко. Используйте различные трубки и ситечко для каждой камеры сердца. Если количество жизнеспособных клеток составляет менее 80%, проверьте время, необходимое для канюляции. Если время наклона составляет более 5 мин, попробуйте другое сердце. Если нет, то провести проверку новых лотов коллагеназы через программу отбора проб коллагеназы. Пелле клетки центрифуги при 215 х г в течение 2 мин. Гранулы должны быть компактными и не рыхлыми. Если гранулы свободны, препарат содержит много мертвых клеток. В капюшоне культуры ткани, resuspend гранулы в 10 мл остановки буфера. Пелле клетки центрифуги при 215 х г в течение 2 мин. Гранулы должны быть компактными и не рыхлыми. Если гранулы свободны, препарат содержит много мертвых клеток. Приостановите работу ячеек в 5 мл покрытия буфера. Выполните подсчет ячеек. Отрегулируйте миллилитров буфера покрытия, чтобы достичь окончательной концентрации миоцита 2 х 104 ячеек на мл. Удалите из инкубатора крышки с ламинином. Аспирируйте капли ламинина. Плита 200 л миоцитной подвески на каждом coverslip. Поместите в инкубатор 37 градусов по Цельсию (21% O2,5% CO2) на 2 ч, чтобы позволить вложение. После 2 ч, аспирировать незакрепленные клетки, добавить 2 мл культуры средств массовой информации, и культуры на срок до 4 дней. 4. Фура-2 Загрузка красителя Сделать 2 мМ фура-2 ацетоксиметил эстер (fura-2 AM) бульонный раствор, добавив 25 л DMSO до 50 мкг порошка fura-2 AM (1 флакон). Aliquot в несколько аликотов. Возьмите 1 аликот фура-2 AM и добавьте к 6 мл покрытия среднего. Вихрь смешать. Удалить 1 шесть хорошо пластины миоцитов из инкубатора. Аспирные сми. Добавьте 1 мл медиа-смеси фура-2 к каждому колодцу. Накрыть тарелку фольгой, оставить тарелку при комнатной температуре и подождать 15 минут. Аспирировать фура-2 медиа-смеси и добавить 1 мл раствора Tyrode к каждой скважине. Накрыть фольгой. Подождите 20 минут при комнатной температуре, чтобы позволить для смыва красителя перед визуализацией. 5. Fluo-4 Загрузка красителя Сделать 1,82 мм фтор-4 ацетоксиметил эстер (фто-4 AM) бульонный раствор, добавив 25 л ДМСО до 50 мкг порошка fluo-4 AM (1 флакон). Aliquot в 8,333 qL aliquots. Возьмите 1 аликот флукот-4 AM бульона и добавить к 6 мл покрытия среды. Вихрь смешать. Удалить 1 шесть хорошо пластины миоцитов из инкубатора. Аспирные сми. Добавьте 1 мл смеси флуко-4 AM мультимедиа к каждому колодцу. Накрыть тарелку фольгой, оставить тарелку при комнатной температуре и подождать 15 минут. Аспирировать фтор-4 AM медиа-смеси и добавить 1 мл раствора Tyrode к каждому хорошо. Накрыть фольгой. Подождите 20 минут при комнатной температуре, чтобы позволить для смыва красителя перед визуализацией. 6. Мембрана Потенциал красителя Загрузка Удалите компонент А и компонент B из мембранного потенциального комплекта. В конической трубке объемом 15 мл смешайте 50 кЛ компонента B и 5 зл компонента A. Vortex для смешивания. Добавьте 10 мл покрытий в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую смесь красителя напряжения. Вихрь смешать. Удалить 1 шесть хорошо пластины миоцитов из инкубатора. Аспирируй средства массовой информации. Добавьте 800 л мембранной потенциальной смеси красителя к каждому колодцу. Накрыть тарелку фольгой, оставить тарелку при комнатной температуре и подождать 15 минут. Аспирировать красителя смеси и добавить 1 мл модифицированного раствора Tyrode к каждому колодцу. Накрыть фольгой. 7. Фотометрия и запись с парового устройства Включите оборудование в следующем порядке: микроскоп, дуговая лампа, гиперпереключатель, система интерфейса флуоресценции, блок питания Myocam, полевой стимулятор и компьютер. Убедитесь, что наборы фильтров для возбуждения/выбросов подходят для красителя изображений.ПРИМЕЧАНИЕ: Fura-2 возбуждается при 340 нм и 380 нм света. Он излучает на 510 нм света. Fluo-4 и мембранный краситель напряжения возбуждаются при 485 нм света и излучают при 520 нм света. Премьер системы, включив вакуум, полностью открывшись шланг зажим, и осторожно погружая каждый 60 мл шприц используется в многообразии. Для записи кальция используйте раствор Tyrode. Для записи напряжения используйте модифицированное решение Tyrode. Включите обогреватель и установите поток, регулируя зажим ролика на перфузионных трубках. Делайте записи по 36 и 1 кС. Откройте программное обеспечение для приобретения. Убедитесь, что параметры установлены для правильного красителя изображения. В темноте, удалить фольгу из шести хорошо пластины и место coverslip в темпе камеры. Убедитесь, что стимулятор выключен во время этого шага. Сосредоточьтесь на миоцитах, используя 10-кратную цель. Оказавшись в фокусе, начните ходить по полостимулирующим при 1 Гц, 0,2 В. Постепенно увеличивайте напряжение до 1:1. Затем увеличить напряжение до 1.5x порог достигается.ПРИМЕЧАНИЕ: Потому что возбуждение-сокращение соединения зависит от температуры, убедитесь, что клетки были perfused в течение 15 минут перед записью. Это позволяет миоцитам оправиться от шока перехода от комнатной температуры до 37 градусов по Цельсию, а также слабо прикрепленные клетки уплыть. Переход от 10-x цели к цели 40x. Сосредоточьтесь на ячейке, которая следует за темпом 1:1. Отрегулируйте пластиковые оттенки, чтобы только одна ячейка находится в поле зрения. Используя программное обеспечение, поместите область интереса поле на четко определенные саркомера. Запустите программное обеспечение приобретения, чтобы инициировать возбуждение света. Используя фильтры нейтральной плотности, отрегулируйте настройки интенсивности соответствующим образом, чтобы получить адекватный SNR.