Luminescence Lifetime Imaging of O<sub>2</sub> with a Frequency-Domain-Based Camera System

Maria Mo&#223;hammer; Vincent  V. Scholz; Gerhard Holst; Michael K&#252;hl; Klaus Koren

doi:10.3791/60191

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Chimie

לומינסנציה הדמיה של החיים של O₂ עם תדר-מערכת מבוססי התחום מצלמה

Published: December 16, 2019

doi:

10.3791/60191

Maria Moßhammer*¹, Vincent V. Scholz*², Gerhard Holst³, Michael Kühl^1,4, Klaus Koren⁵

¹Marine Biological Section, Department of Biology,University of Copenhagen, ²Center for Electromicrobiology,Aarhus University, ³PCO AG, ⁴Climate Change Cluster,University of Technology Sydney, ⁵Aarhus University Centre for Water Technology, Section for Microbiology, Department of Bioscience,Aarhus University

Summary

אנו מתארים את השימוש של רומן, תדר-תחום מצלמה לאורך החיים עבור מיפוי 2D O₂ הפצות עם משטח חיישן אופטי. מערכת המצלמה וניתוח התמונה הליכים מתוארים יחד עם ההכנה, כיול ויישום של כנפונים חיישן עבור המחשה O₂ מיקרו הסביבה בריזוספירה של צמחים ימיים.

Abstract

אנו מתארים שיטה התמונה מומס חמצן (O₂), ב 2d ב מרחבית גבוהה (< 50-100 μm) ו הזמני (< 10 s) החלטה. השיטה מעסיקה O₂ בעלי חיישן האור הזורח רגיש (אלקטרואופטיקה מישורי) בשילוב עם מערכת מצלמה מיוחדת עבור הדמיה לאור החיים בתחום התדר. אלקטרואופטיקה מישורי מוכנים על ידי המסת הצבע O₂רגיש אינדיקטור פולימר והפצת התערובת על תמיכה מוצקה בעובי מוגדר באמצעות ציפוי סכין. לאחר אידוי של הממס, אלקטרואופטיקה מישורי ממוקם במגע קרוב עם מדגם של עניין-כאן הפגינו עם שורשי הצמח הימי המים הקטנים Orella. O₂ שינוי תלוי ריכוז במשך החיים לאור של צבע מחוון בתוך אלקטרואופטיקה מישורי היא התמונה באמצעות הישבן של הנושא שקוף רדיד הקיר אקווריום באמצעות מצלמה מיוחדת. מצלמה זו מודדת את אורך החיים האור (μs) באמצעות משמרת בזווית הפאזה בין אות עירור מאופנן ואות פליטה. שיטה זו עדיפה על האור האור שיטות הדמיה, כמו האות אינו תלוי בריכוז הצבע או האינטנסיביות של מקור עירור, והוא מסתמך אך ורק על הזמן ניוון הלומיאלי, שהוא פרמטר מיסודה ההפניה. כתוצאה מכך אין צורך להוסיף צבע התייחסות נוסף או אמצעים אחרים להפניה. אנו להדגים את השימוש במערכת עבור מאקרוסקופי O₂ הדמיה של הצמח הריון, אבל מערכת המצלמה יכול גם בקלות להיות מצמידים למיקרוסקופ.

Introduction

התפלגות ודינמיקה של גזים ויונים מומס במשקעים וקרקעות מספקים מידע מרכזי על תהליכים ביו-כימיים כגון נשימה מיקרוביאלית¹^,², או אובדן חמצן רדיאלי משורשי צמחים³^,⁴^,⁵, ומיקרואקולוגיה כימית של חיידקים⁶^,⁷, צמח כדורים⁵^,⁸^,⁹ בעלי חיים בורוז¹⁰^, ¹¹^,¹². פעילות ביולוגית וכימית בסביבות מוגבלות מסוג זה יכולים ליצור מעברי צבע תלולים של מצעים כימיים או מוצרים של תהליכים ביוגיאוכימיים. במיוחד, O₂ זמינות יש השפעה עצומה על תהליכים ביוגיאוכימיים ולכן ביולוגיה ואקולוגיה של מערכת¹³. משום כך, ניתוח O₂ ריכוזי מרחבי המרחב הגבוה והרזולוציה הטמפורלית הוא בעל חשיבות עליונה במדעי המים והיבשה. ראשון, אלקטרוכימי מיקרוחיישנים אופטיים¹⁴^,¹⁵ פותחו כדי למדוד את זה האנליטה חשוב. מאוחר יותר, 2 מימדי (2d) הדמיה של O₂ עם אלקטרואופטיקה מישורי הוצגה¹²^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹, אשר איפשר את ההדמיה ואת הקוונפיקציה של התפלגות o₂ הטרוגנית קרקעות משקעים.

מישורי O₂ אלקטרואופטיקה מורכב o₂רגיש אינדיקטור מחוון²⁰, אשר מומס פולימר מתאים²¹. צבע האינדיקטור נרגש באורכי גל אופטי מסוים ופולט אור אדום הוזז על הרפיה בצורה של לומינציה. בנוכחות O₂, צבע מחוון נרגש יכול להעביר את האנרגיה שלה למולקולה O₂ על התנגשות, אשר המכונה התנגשות מבוססי מבוסס לומיצ’ינג²². לכן, את עוצמת האור כמו גם את החיים האור מופחת עם הגדלת O₂ ריכוז²³. במקרה אידיאלי השינוי בעוצמה ובמשך החיים עוקב אחר משוואת שטרן-וולמר (משוואה 1) תוך שימוש בעוצמת האור או החיים בהעדר (אני₀; τ₀) או נוכחות (i, τ) של O₂ בריכוז נתון [Q]. קבוע שטרן-Volmer (K_sv) הוא מדד לרגישות של האופדה לכיוון O₂; K_SV תלוי במשתנים סביבתיים כגון טמפרטורה ולחץ.

1

הקלטת שינויים כאלה באור השמש חיישן מישורי עם מערכת המצלמה ניתן להשתמש כדי להמחיש את השינויים המתאימים בהתפלגות O₂ . בתחילה, הדמיה פשוטה המבוססת על O₂ דימות היה בשימוש¹⁸. עם זאת, מתודולוגיה כזו רגישה מאוד לאינטרפרעות חיצוניות, אשר מתפשרים על אמינות התוצאות בשל תאורה הטרוגנית, תנודות במקור העירור או המצלמה, כמו גם התפלגות אחידה של צבע האינדיקטור בתוך אלקטרואופטיקה מישורי.

חלק ממגבלות אלה ניתן להקל על ידי שימוש אלקטרואופטיקה מישורי עבור הדמיה טימטרי¹⁷^,²⁴, שם מחוון O₂רגיש אינדיקטור הוא co-קיבוע בשכבת הפולימר של אלקטרואופטיקה מישורי עם צבע התייחסות רגיש פולט בטווח ספקטרלי שונה מאשר O₂אינדיקטור. בהתבסס על תמונות פליטה שנרכשו בשני חלונות ספקטרלי, אות הפליטה הרגיש O₂מחולק באות ההתייחסות, יצירת תמונת יחס שנוטה פחות^לתוךהפרעות שהוזכרו לעיל 5^,¹⁷. השיטה דורשת שימוש בצבע השני, אשר באופן אידיאלי יכול להיות נרגש על ידי אותו מקור עירור, אבל פולט באורך גל שונה (ללא חפיפה משמעותית ספקטרלי), בחלון ספקטרלי אחר של המצלמה (למשל, בערוץ צבע אחר של מצלמת RGB).

לחילופין, O₂ הדמיה יכולה להיות מבוססת על ככמת את שינוי O₂תלוי במשך החיים הזוהר של צבע מחוון, אשר אינו מושפע התאורה לא אחידה או הטרוגננים בריכוז אינדיקטור²⁵. ראשון לומינסנציה החיים מבוסס O₂ מערכות הדמיה היו מבוססים על מדידות בתחום הזמן עם שער ניתן טעונה מצמידים המכשיר (CCD) מערכת מצלמה²⁶, שם מקור עירור פעמו משמש ותמונות לאור הם נלקחים על מרווחי זמן מוגדרים בתוך עירור או פליטה של המחוון⁸^,²³^,²⁷. מתוך תמונות כאלה, אורך חיים האור יכול להיקבע ומתואם הריכוז O₂ המתאים בכיול. לאחר מכן, תמונות במשך החיים של האור עבור מדגם נתון לחצה נגד אלקטרואופטיקה מישורי ניתן להמיר תמונות של התפלגות דו-ממדית התואמת O₂ ריכוז. מערכת זו נעשה שימוש ביישומים רבים הן במעבדה באתרו¹⁶^,²⁸, אבל מצלמת מצלמות חיוניות שער מסוגל הוא כבר לא זמין מסחרית.

לאחרונה, שוחרר מערכת מצלמת חיים שונה לאור השנים, הרוכשת תמונות בתדר-דומיין⁸. המערכת מסתמכת על מקור אור ברציפות מאופנן לעירור. זה יכול להיות גל sinusoidal או מרובע במקום עירור פעמו, אשר משמש לרכישת תמונה בתחום הזמן. אפנון זה מביא לפליטת הזדקנות מאופנן של צבע O₂ מחוון, שהוא שלב מוזז על ידי זווית, φ, אשר תלויה בחיים האור של צבע מחוון (τ) (ראה משוואה 2).

2

השינוי בין עירור לשרעת הפליטה (כלומר, מדד האפנון או העומק (משרעת המחולקת לאור מתמשך)) תלוי גם באורך החיים של האור. כך, על ידי הגדרת תדירות אפנון הידוע חיישן cmos מיוחד בתוך המצלמה הוא מסוגל למדוד את החיים לומינסנציה ב-ns לטווח μs כמתואר בפירוט במקום אחר ⁸^,²⁹^,³⁰. מדריך כללי על עקרון הפעולה ניתן למצוא (באמצעות הקישור הבא https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8).

בפרוטוקול הבא, אנו מדגימים את השימוש במערכת המצלמה הרומן לדימות התפלגות של O₂ ריכוז סביב השורשים של הצמח מים מתוקים מימיים ליטל orella אניפלורה ב 2d⁹^,³¹. היינו רוצים להדגיש כי שיטה זו היא בשום דרך לא מוגבלת יישום זה. אופדות רגישים לחמצן או חלקיקי חיישן²⁷ בשילוב עם שיטות דימות שונות שימשו במחקר רפואי³², ב ביורינטינג³³, עבור צבעים רגישים ללחץ³⁴^,³⁵, או ללמוד מערכות פוטוסינתטית²^,³⁶^,³⁷, רק לתת שם כמה תחומים אחרים של יישום.

Protocol

1. ייצור מישורי O2 אלקטרואופטיקה התמוססות 1.5 מ”ג של פלטינה מחוון מסוג O2 (II)-5, 10, 15, 20-הטטרקיס-(2, 3, 4, 5, 6-פנטטפניל)-פורברין (pttfpp) ו 100 mg של פוליסטירן (PS) ב 1 גרם של כלורופורם כדי לקבל את מה שנקרא ‘ החיישן של ההערה: ניתן לשמור את הקוקטייל בבקבוקון זכוכית סגור והדוק במשך כמה שעות במקרר ובחשיכה עד לשימוש נוסף. תיקון נקי, אבקת פוליאתילן ללא אבק (PET) רדיד אלומיניום (גודל תלוי ביישום) על צלחת זכוכית מנוקה בעזרת מים או אתנול (70%) סרט (איור 1א). מניחים את המכשיר ציפוי סכין מנוקה (120 μm) על נייר הכסף ולהחיל קו של קוקטייל החיישן מול המכשיר באמצעות פיפטה זכוכית (איור 1B). לאחר מכן, גרור את המכשיר ציפוי סכין לאט ואחיד על רדיד הנייר PET כדי לפזר את הקוקטייל באופן שווה.הערה: יש לנקות את כל החומרים והכלים באופן יסודי ולבצע את הייצור בסביבה נטולת אבק, כגון כיסוי, ספסל או מתחת למכשיר יניקה נקודה. כדי למנוע הטרולקשרים ברדיד החיישן הסופי, השלבים הבאים בעקבות היישום של קוקטייל החיישן על רדיד הנייר צריך להיעשות במהירות, כמו כלורופורם מתאדה מהר. יבש מישורי סיים O2-רגיש באוויר הסביבתי 1 h ולאחר מכן לילה בארון חימום ב 50-60 ° c, וכתוצאה מכך עובי שכבה סופית לאחר אידוי הממס של ~ 12 μm. לאחסן את אלקטרואופטיקה המיוצר בחושך (למשל, במעטפה נייר) עד שימוש נוסף (איור 1ג).הערה: מישורי O2 אלקטרואופטיקה ניתן לאחסן יבש בחשיכה במשך מספר חודשים עד שנים לפני השימוש. עובי השכבה הסופית החל מ 1-20 יקרומטר הוכיחה לספק תוצאות טובות, עם אות האור האור מספיק זמני תגובה נאותה. 2. ריזוזו-תא סנדוויץ ‘ נקה שתי צלחות זכוכית (24.5 x 14 ס”מ2, עובי: 4 מ”מ) עם 96% אתנול. השתמש בדבק מיידי לריפוי באור, אקריליק (ראה טבלת חומרים) כדי להדביק שקופיות מיקרוסקופ (76 x 26 מ”מ2, עובי: 1 מ”מ) לאורך השוליים של צלחת הזכוכית הראשונה (כלומר, הצד האחורי של החדר), תוך השארת יתרון ארוך אחד פתוח. השתמש בחותך זכוכית כדי לקצר שקופיות מיקרוסקופ לפי הצורך.התראה: זכוכית חותכת יכולה לגרום לקצוות חדים ויש לטפל בהם בזהירות.הערה: שקופיות המיקרוסקופ מתפקד כרווחים בין החזית והגב, ובהתאם לעובי השורשים וגודל הצמח, שכבות מרובות של שקופיות מיקרוסקופ יכולות להיות מודבקות זו על גבי זו. חותכים את אלקטרואופטיקה מישורי לתוך הצורה הנדרשת גודל כדי להתאים לחלל בין שקופיות מיקרוסקופ מודבק. מניחים אותו על החלק הפנימי של צלחת הזכוכית הקדמית עם הצד המצופה כלפי מעלה, כדי לאפשר מגע עם דגימת הריבית כאשר לוחצים עליו. קלטת קצה אחד של אופדה לסכל את צלחת הזכוכית ולהוסיף כמה טיפות של מי ברז בין צלחת הזכוכית על נייר הכסף (איור 2א). להוריד באיטיות את רדיד האלומיניום על טיפות המים האלה ומאפשרים לו ליישר את עצמו על פני הזכוכית. בזהירות להסיר בועות אוויר לכוד בין אלקטרואופטיקה מישורי ואת צלחת הזכוכית באמצעות רקמה רכה, תוך הימנעות גירוד של ציפוי החיישן. לנגב את צלחת הזכוכית יבש הקלטת את הקצוות הנותרים של אופדה לסכל את צלחת הזכוכית (איור 2ב).הערה: יש לבחור קלטת עם הדבקה מתאימה מתחת למים. מסננת את המשקע באמצעות שינוי גודל של 0.5 מ”מ. מניחים כף של משקע רטוב על צלחת הזכוכית הראשונה (איור 2ג).הערה: גודל הרשת אינו אמור להיות גדול ממחצית עובי הרווח. הפיצו את המשקע באופן שווה והתאימו אותו לעובי של מפרידי המיקרוסקופ בעזרת צלחת זכוכית שטוחה. נקה בזהירות את המשטח העליון של שקופיות המיקרוסקופ כדי להבטיח את צלחת הזכוכית השנייה חותמות את התא כראוי. החלת גריז סיליקון על משטח שקופית המיקרוסקופ. לכסות את המשקע עם סרט מים דקים, תוך הימנעות בזהירות היווצרות של בועות אוויר. בזהירות לשטוף לירות אחד של הקטן or, אניפלורה ומניחים אותו על המשקע, עם העלים הצמח בולט בצד הפתוח העליון (איור 2ד). מניחים את צלחת הזכוכית השנייה, עם אלקטרואופטיקה מחובר אליו, על המשקע ולהחיל לחץ עדין כדי להביא את אלקטרואופטיקה במגע קרוב עם שורשי הצמח ואת המשקע המקיף.הערה: בועות אוויר הלכודים במשקע ניתן להסיר על ידי הטיית צלחות זכוכית תוך הבאת אותם יחד. הדק את צלחות הזכוכית יחד בעזרת התפסים (איור 2E). נגב את הקצוות החיצוניים. עם נייר טישו שמור על העלים לחות במהלך ההרכבה כולה של כריך ריזוזו (למשל, על ידי תוספת תכופה של כמה טיפות מים). הדקו את תא הסנדוויץ ‘ ההוא. בעזרת נייר דבק ויניל חותם את הקצוות עם חימר מידול ובנוסף להדביק אותם עם קלטת ויניל חשמלי (איור 2F).הערה: אם יש הרבה בועות אוויר במשקע, או גרגירי משקעים בין שקופיות המיקרוסקופ מרווח לבין צלחת הזכוכית השנייה, החדר צריך להיות מאויר כמו מים נקבוביות יכול לדלוף החוצה (חזור על שלבים 2.4-2.8). השתמש פלסטיק אטום לכסות את הכריך, אבל להשאיר חתך בנייר הכסף עבור הצמח עוזב להישאר. חותכים חלון רדיד פלסטיק, כך שניתן לפתוח את הניסויים על ידי התגלגלות. סגור את החלון בזמן ההסתגלות באמצעות גומיות (איור 2G) כדי להגן על אלקטרואופטיקה מפני הלבנת תמונות בזמן שהמפעל מודגן.הערה: כאשר צמיחת פריחת אצות עלולה להפריע לריכוזים של O2 , אנו ממליצים לנסות למזער אותה, תוך שימוש במים מסוננים, ניקוי מראש של ציוד ניסיוני והסרת אצות על המבנה. 3. ריזוזו-הדגירה הקאמרית של סנדוויץ ‘ מניחים את החדר ריזו-סנדוויץ במיכל מים (32 x 7 x 28 ס”מ3) בעמדה מוטה מעט כדי לעודד צמיחת השורש נגד אלקטרואופטיקה מישורי. למלא את מיכל המים עם מספיק מים כדי להטביע במלואו את העלים הצמח. להקים אור 14 h, 10 h מחזור כהה עבור ההסתגלות של הצמח באמצעות מנורה מבוקרת זמן. מניחים אבן-אוויר או משאבת מים במיכל כדי להבטיח התפרות וערבוב של המים (איור 2שעות). 4. הדמיה הגדרת הדמיה הסר את רדיד הפלסטיק המכסה את האופנדה מישורי בחדר הכריך. מקמו את החדר עם קיר הזכוכית עם אופדה זקוף נגד קיר האקווריום. השתמש מרווח כדי ללחוץ על חדר הסנדוויץ ‘ ריאזו נגד קיר האקווריום.הערה: העובי הכולל של קיר האקווריום בתוספת הקיר החדר כריך-סנדוויץ ‘ לא צריך לקבל עבה מדי, עם זאת, עוביים זכוכית לקירות aquaria עבור הדמיה האור מומלצים עם > 1 ס מ, על מנת להקטין את הדיבור מרחבי על ידי הגדלת הנחתה של האורות מפוזרים. חשוב להשתמש באותו חומר לקירות זכוכית (אותו אינדקס עקשן), כדי למזער את פיזור האור בממשק החומרי; כמו זה יוביל תמונה מטושטשת כמו גם12. מקום התדר-תחום המבוסס על מצלמת חיים המבוססת על מטרה (ראה טבלת חומרים) מול האקווריום ואת האזור של עניין (שורשים של צמח מימי המים הקטנים, אשר נמצאים במגע ישיר עם אלקטרואופטיקה מישורי) (איור 3).הערה: ייתכן שהמצלמה ממוקמת על דוכן מעבדה כדי לאפשר התאמת גובה קלה של המצלמה. יש לסמן את מיקום מעמד המעבדה ולתקן אותו. בנוסף, ניתן לדבוק במצלמה למעמד המעבדה כדי להימנע מתנועה מקרית של המצלמה במהלך הניסוי. בורג מסנן פליטה מתאים לדימות PtTFPP כמו צבע אינדיקטור (ראה טבלת חומרים) על מטרת המצלמה, כדי להסיר מסקנות מן המקור עירור.הערה: מסנני ‘ מברגים ‘ הם אידיאליים, אך ניתן להשתמש במסננים מרובעים גם עם מתאם מתאים, או באמצעות הקלטה זהירה למטרה. חבר מקור עירור של LED (ראה טבלת חומרים) לאפנון ופלט שער כהה של המצלמה.הערה: הראשון מספק את אות האפנון למקור האור, בעוד האחרון מנתק את האור במהלך הבדיקה התמונה של חיישן התמונה. חבר את מקור עירור הנורית והמצלמה למחשב. יש למזער את אור הרקע במהלך בדיקת התמונה, על-ידי הכהיית החדר כולו או הצבת מטלית שחורה צפופה על הגדרת כולה. במקרה האחרון, חשוב להבטיח אוורור מספיק כדי למנוע חימום של המצלמה. תקן את מדריך האור במקור עירור הנורית ומקם אותו כדי להאיר באופן שווה את נייר הכסף מישורי המכסה את אזור הריבית.הערה: במקור עירור משמש LED ניתן לעבור בין 3 נוריות שונות (460 nm, 528 nm, 625 nm), את עוצמת אשר ניתן לכוונן באמצעות תוכנת הבקרה. פעולת הגדרות ומצלמההערה: עבור הניסויים המתוארים, השתמשנו במצלמת החיים בתדר מבוסס-תחום בשילוב עם מודול ייעודי לדימות לכל החיים בחבילת תוכנה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים). בחר את המצלמה בתוכנה שנבחרה לפני השימוש.הערה: יש להתקין את מנהלי התוכנות והמצלמה לפני הדמיה בעקבות הנחיות היצרנים. פתח את תוכנת בקרת ה-LED (שהותקנה שוב לפני תחילת הניסוי) ובחר בנורית המתאימה (כאן: 528 nm) על-ידי תקתוק המתנה. הגדר את עוצמת ה-LED לפי הצורך (כאן עד 30%). ודא שנורית ה-LED מופעלת על-ידי ה-TTL החיצוני; פעולה זו מתבצעת על-ידי אנלוגי מתקתק ומסונכרן עבור הנורית.הערה: עוצמת ה-LED צריך להיות מותאם בנפרד, כמו כוח לייזר גבוה מדי יכול להוביל הלבנת תמונה מואצת של המחוון או צבע התייחסות. למקד את המצלמה ולהתאים את הצמצם של המטרה באופן ידני (במהלך המחקר הנוכחי f = 2.8).הערה: חשוב למקד את המצלמה על אופדה מישורי ולא על זכוכית האקווריום; זה יכול להיות מובטחת על ידי לקיחת תמונה עם סרגל לקנה מידה, והתמקדות על הצל של הסרגל על אופדה, ולא על הסרגל בפועל. הגדר את הפרמטרים הבאים בתוך לוח הבקרה של מצלמת התוכנה: מקור אפנון פנימי; גל סינוס עבור הפלט בצורת גל; דגימת פאזה נוספת (כן); 8 דגימות פאזה, סדר שלב להיפך, הקש A + B בדיקה; 5 תדירות אפנון kHz.הערה: פרמטרים אלה משפיעים על איכות התמונה וניתן לשנותה במידת הצורך. יצרן המצלמה מספק קווים מנחים לגבי הפרמטרים הבודדים (יצרן המצלמה משחרר הנחיות ועדכונים בכל פעם שהתוכנה מתעדכנת). קח תמונת ייחוס לפני ניסויים.הערה: ניתן לעשות זאת גם על ידי דימות תקן כיול (צבע זורח עם חיים ידועים (ns או μs)), או באמצעות האור המשתקף של ה-LED. במקרה האחרון, מסנן להעביר אורך פליטה צריך להיות מוסר מן המטרה ואת החיים הידועים ניתן להגדיר 1 ns. כוונן את זמן החשיפה במקטע הכיול של תוכנת הדימות הייעודית עד שהנתון הסטטיסטי של ROI (בתחתית פאנל זה) יהיה בטווח של 0.68-0.72.הערה: כעת אורך חיים ההתייחסות (לדוגמה, 1 ns) מוענק כקלט לתוכנה. לחץ על הפניית לכידה כדי להתחיל ברכישת סדרת מדידת ייחוס.הערה: לאחר סיום, נתוני הייחוס מאוחסנים וניתן לבצע מדידות בודדות או בזמן הקפיצה בדגימות. כיול של O2 אופדה מיקום פיסת מישורי או2רגישים באקווריום (קטן) זכוכית. תקן את אופדה מישורי על קיר הזכוכית של תא הכיול כפי שתואר קודם לכן (ראה סעיף 2.3). הצב את אקווריום הכיול מול המצלמה. יש לוודא גם תאורה על ידי ה-LED, כמו גם את האופדה ממלא את כל השדה של נוף.הערה: אלקטרואופטיקה מישורי צריך להיות מאותו פיסת נייר או עשוי מאותו קוקטייל חיישן כמו רדיד האלומיניום המשמש בניסוי בפועל. למלא את האקווריום עם אותו מדיום נוזלי כמו בשימוש בניסויים.הערה: שימוש באמצעי אחסון שונים לכיול ולניסויים יכולים להשפיע על המדידה, (למשל, על ידי שינוי תגובת החיישן ו/או מסיסות האו2 ). לפיכך, יש לבצע כיול באותו מדיום, ובאותה טמפרטורה של הניסוי הממשי. תנודות בטמפרטורה ישפיע על אות האור וצריך להימנע. עם זאת, אם לא ניתן לשמור על הטמפרטורה יציבה, פיצוי טמפרטורה צריך להיעשות על ידי כיול את האופדה הרגיש O2(מספר נקודות) בטמפרטורות שונות (רלוונטיות) וחישוב מחדש של הערכים. להתאים את הריכוז O2 בתוך אקווריום כיול ידי שטיפה את המים עם אוויר/N2 תערובת גז של ריכוז O2 הידוע, באמצעות מכשיר ערבוב גז. ודאו שהמים מצוידים היטב בתערובת הדלק המשמשת לשימוש באמצעות מרססים במשך זמן מספיק (תלוי בקצב הזרימה ובגודל האקווריום).הערה: אנו ממליצים לעקוב אחר רמת O2 באקווריום כיול עם חיצוני, מכויל O2 חיישן עם הטמפרטורה פיצוי (g., באמצעות סיבי סיבים אופטיים או אלקטרוכימי o2 חיישן). קח סדרה של תמונות בריכוזים שונים O2 בחדר הכיול.הערה: יש למדוד לפחות חמישה שונים של ריכוזי O2 על מנת לאפשר התאמה של עיקול מתאים לנתוני הכיול הנרכשים. חשוב למדוד ב -0 hPa (תנאי anoxic) ולאחר מכן להפיץ את הערכים האחרים בטווח הדינמי של צבע המחוון הספציפי שלך. כאן השתמשנו PtTFPP כמו צבע O2רגיש מקיבוע מטריצה פוליסטירן. תמונות נלקחו ב 0, 48, 102, 156, ו 207 hPa; 207 hPa מקבילה ל-100% רוויית האוויר במליחות ובלחץ הנתון. הדמיה של המדגם מניחים את המדגם מול המצלמה ומבטיחים גם תאורה. כבה את האור המספק הקרנה למפעל (ולכל מקורות האור האחרים) רק לפני הרכישה של תמונת החיים של הצמח. התאם את זמן הרכישה בהתאם לתמונת העוצמה, וודא שהאות אינו רווי יתר ואינו חלש מדי בכדי לאותת טוב לעוצמת הקול (S/N) בקביעת משך החיים. לחשוף את הצמח לתנאי אור שונים (למשל, אור/כהה) ולרכוש קבוצה של תמונות. מדליקים את האור בחדר כדי לרכוש תמונה מבנית.הערה: כאשר נורית הרקע מופעלת, המצלמה לא תמדוד תמונת חיים ריאליסטית. עם זאת, הדימוי האינטנסיביות מציג כעת את שדה התצוגה כולו כפי שנראה דרך האופדה השקוף למחצה. צלם תמונה עם סרגל או זהה בשדה התצוגה כדי לאפשר שינוי גודל מאוחר יותר של התמונות שנרכשו. 5. ניתוח נתונים לייצא את אורך החיים של השלב ואת העוצמה תמונות ישירות מתוך תוכנת דימות ייעודי, באמצעות מאקרו שסופקו על ידי יצרן המצלמה. בצע ניתוח תמונה נוסף באמצעות תוכנת ניתוח תמונה זמינה באופן חופשי (ראה טבלת חומרים). פתחו את תמונות האורך של כל החיים של הכיול בתוכנת ניתוח התמונה וקבעו את הממוצע של התמונה כולה באמצעות הפונקציה מדידה. התווה את משך החיים הנמדד נגד ריכוזי O2 המוכרים כדי לקבוע את פונקציית הכיול (איור 4א). חישוב τ0/τ מכל הנתונים (τ0 הוא משך החיים של השלב הנמדד בהעדר O2). התווה ערכים אלה לעומת ריכוזי O2 הידועים (איור 4ב’). לקבוע את הפרמטרים Ksv ו- f מתוך העלילה כיול, באמצעות מודל שני האתרים הפשוטים עבור מקושה דינמי (משוואה 3)38,39 שם [Q] הוא ריכוז O2 . הגדר את ההתאמה לפונקציה בתוכנת ניתוח הנתונים, אשר לאחר מכן קובעת Ksv ו-f. 3 פתח את התמונות לדוגמה שנרכשו בתוכנה לניתוח תמונות כדי להמיר את אורך החיים של התמונה לריכוזים של O2 , תוך שימוש בפרמטרים הקבועים של Ksv, f ו- τ0.הערה: באפשרותך להשתמש באופן ישיר בגישה חלופית גם בערכי החיים של שלב הכיול הנרכש (איור 4א). במקרה זה, משמשת התאמה מעריכית באמצעות הפונקציה ‘ התאמה לעקומה ‘ לכיול. פתחו את התמונה עם הסרגל הבא בתוכנת ניתוח התמונה ומדדו מרחק ידוע בעזרת כלי המדידה. הגדר מדידה זו כקנה מידה גלובלי תחת קנה מידה קבוע.

Representative Results

כדוגמה ליישום עבור מערכת ההדמיה החדשה, אנו מראים 2D O2 הדמיה של מדגם ביולוגי מורכב (כלומר, הריון של צמח המים הקטן orella). ראשית, השיטה מתארת את הייצור של סרט חיישן מישורי, אלקטרואופטיקה כביכול מישורי. כפי שנראה באיור 1, מעין אופדה זו עשויה משכבה דקה של אינדיקטור אופטי במטריצה הכפולה התפשטה בתמיכה שקופה. בעקבות הפרוטוקול המתואר, הסרט חיישן הומוגנית עם עובי אחיד, כפי שהוגדר על ידי הפער של המכשיר ציפוי הסכין, מתקבל. אם לאופדה המיוצר יש התפלגות בחומר החיישן לא סדיר (למשל, חורים בציפוי, מראה פסים, או אגרגטים לצבוע (זה יכול להיות מוערך חזותית, ובאופן חזותי בעזרת מנורת UV)), הפרוטוקול צריך לחזור על כל החומרים צריך להיות ניקה ביסודיות באמצעות אצטון. לאחר אלקטרואופטיקה מישורי מוכן, המדגם ניתן להביא במגע הקרוב עם שכבת חישה של אלקטרואופטיקה מישורי, כפי שמוצג כאן עם אלקטרואופטיקה מישורי משולבים בחדר כריך ריזוזו, שם השורשים של צמח בתוך מטריצת משקעים שמסביב יכול להיות ממוקם במגע קרוב אלקטרואופטיקה מישורי (איור 2). אם הוא מוכן נכון, החדר של כריך ריזו-סנדוויץ ‘ צריך להיות ניידים בקלות מאקווריום אחד (דגירה) לאחר (מדידה). אם לא נבנה כראוי, החדר הסנדוויץ ‘ ריזו-סנדביץ ‘ עשוי להיות מסוגל, לאבד משקעים או להכיל בועות אוויר. הבדיקה החזותית של החדר הסנדוויץ ‘ הישר אחרי ההרכבה מומלצת לכן. הפרוטוקול הנתון מאפשר תדר-תחום מבוסס האור החיים מבוססי הדמיה של המדגם במגע עם אלקטרואופטיקה מישורי באמצעות תדר-דומיין מבוססי מצלמה מבוסס חיים. פרטים נוספים על מערכת מצלמה זו כגון המצב של רכישת תמונה ומאפייני מצלמה משלימה תחמוצת מתכת-מוליך למחצה (scmos) מאפיינים ניתנים בפרסומים האחרונים8,29. הכיוונון עצמו הוא פשוט למדי וכולל רק את המצלמה השולטת מקור אור (במקרה זה, מקור עירור של LED) ואת המדגם עם אלקטרואופטיקה (איור 3). ודא שכל החלקים מחוברים כראוי ושהמדגם מואר באופן הומוגנטי. יש להימנע מתאורת רקע בעת יצירת מדידות מקדימות. לפני הדמיה של המדגם, את האופדה צריך להיות מכויל. כפי שנראה באיור 4א, משך החיים הנמדד מקטין עם הגדלת O2 ריכוז בעקבות ריקבון מעריכי. ניתן לתאר מערכת יחסים זו גם באמצעות מודל דו-האתר הפשוט (איור 4ב’ ומשוואה 3). בדוגמה הנתונה, הפרמטרים הנחוצים לחישוב הריכוז O2 היו כלאחר מכן; τ0 = 56.26 μs, KSv = 0.032 hpa-1 ו- f = 0.86. ביצוע כיול הוא גם דרך אידיאלית לבדוק שהמערכת פועלת כהלכה. אם כל הרכיבים מותקנים כמתואר כאן (או בתוך הקווים המנחים של היצרנים), תקופת החיים הנמדדת צריכה להראות את אותו התלות O2 כפי שנראה באיור 4. בנוסף, עבור אותו שילוב של O2 חומרי חישה (פולימר וצבען), τ0 נמדד צריך להיות בטווח זהה (± a כמה μs) כפי שנמדד כאן (בעיקר מושפע הטמפרטורה הניסיונית). אם לא ניתן לקבל עקומת כיול דומה, ודא שכל השלבים הופעלו בצורה נכונה. לפעמים האופדה מקובע בטעות עם הצד הרגיש שפונה לקיר הזכוכית ולא במדגם, או שהתמונות שנרכשו הן מעל או חשופות. עם פרמטרי הכיול, ניתן לקבוע את הריכוז O2 על ידי הדמיה של חיים האור (τ). זה מוצג באיור 5A, B, שבו התפלגות של O2 ריכוז בריזוספירה של היוניפלורה הקטנה והקטנה היה התמונה באפלה ולאחר חשיפה לאור 500 μm הפוטונים מ-2 s-1 עבור 12 h, בהתאמה. בשל הפעילות הפוטוסינתטית של המפעל, הריכוז O2 בתוך הריזוספירה גדל לאחר חשיפה לאור. מלבד תמונות החיים, גם “מבנית” תמונות ניתן לרכוש תחת תאורה חיצונית, תוך שמירה על הגיאומטריה הדמיה קבוע. בדרך זו, O2 תמונות יכול להיות מתואם בדיוק את התמונה המבנית (איור 5ג), לחצות סעיפים או אזורים של עניין. כדוגמה, O2 פרופילי ריכוז על פני שורש אחד חולצו מהתמונה שנרכשה בחושך ובאור, בהתאמה (איור 5ד). איור 1: ייצור מישורי O2 אופדה. (א) רדיד מחמד הוא קבוע על צלחת זכוכית המכשיר ציפוי סכין מושם על נייר הכסף. (ב) קוקטייל החיישן המוכן מתפשט על רדיד המחמד כמו קו דק מול המכשיר ציפוי סכין. (ג) המכשיר ציפוי סכין מועבר כלפי מטה כדי להפיץ את הקוקטייל חיישן כמו סרט דק על רדיד המחמד, אשר לאחר אידוי הממס תוצאות מוכן להשתמש אלקטרואופטיקה מישורי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: האסיפה הקאמרית של הכריך עם שילוב של מישורי O2 אלקטרואופטיקה. (א) אלקטרואופטיקה מתוקנת על אחת מלוחות הזכוכית באמצעות סרט מים. (ב) האופדה מודבק לצלחת עם הקלטת החשמלית. (ג) משקע מתמלא לתוך הלוחית הנגדית עם החללים המצורפים (כלומר, שקופיות מיקרוסקופ). (ד) שורשי הצמחים מונחים על המשקע הנפרש באופן שווה. (ה) חדר הכריך של ריזו-סנדוויץ ‘ סגור ותוקן באופן זמני עם מלחציים. (ו) נסגר לגמרי והורכב מחדר סנדוויץ ‘. (G) כדי להגן על אלקטרואופטיקה מפני חשיפה באור על ידי מנורת הדגירה וכדי למנוע צמיחה פריחת אצות כיסוי פלסטיק ממוקם על הקאמרית התאספו-סנדוויץ ‘. (ח) חדר הסנדוויץ ‘ הישן מתחזה באקווריום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: הגדרת הדמיה המכילה את התדר המבוסס על מצלמה מבוססת-תחום, עם המטרה המתמקדת במדגם עם אלקטרואופטיקה מאחור דרך האקווריום השקוף והקירות הקאמריים של כריך. מדריך האור של מקור עירור ה-LED ממוקם כדי להאיר את המדגם באופן שווה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: כיול עקומות עבור מישורי O2 אלקטרואופטיקה. (A) תקופות חייםזרחתיים שונות הנמדד בריכוזים של O 2 בחדר הכיול מלא המים. (ב) שטרן-וולמר של נתוני הכיול הותאמו באמצעות מודל שני האתרים הפשוט ביותר לקוצ’ינג דינמי (משוואה 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: הדמיה של גלגול החיים של התפלגות O2 בתוך הצמח הימי של המפעל הימי הקטן orella. (A) O2 הפצה לאחר שמירה על הצמח מתחת לאור עבור 12 h ב כ 500μ:4 -1. (ב) O2 הפצה לאחר שמירה על המפעל בחושך עבור 1 h. (ג) דמות מבנית של שורשי הצמח כפי שנראה דרך אלקטרואופטיקה מישורי. (ד) חתך הרוחב2 פרופיל הריכוז (המיקום מצוין על ידי הקו הצהוב בלוח A ו-B) לאחר 12 h באור (אדום) ו-1 h בחשיכה (שחור). הותאם בהיתר מ (קורן, ק., מוסקוביץ ‘, מ., שולס, V. V., בוריסוב, ס, הולסט, ג, קוהל, מ. לומינסנציה הדמיה של החיים של חיישנים כימיים-השוואה בין מחשבים-תחום ומערכות תדר מבוסס-תחום מצלמה. כימיה אנליטית. 91 (5), 3233-3238, דוי: 10.1021/acs. המאמאנכימיה 8b05869 (2019)). זכויות יוצרים (2019) האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

בפרוטוקול זה, זרימת העבודה כולה מן ההכנה של אלקטרואופטיקה ל-O₂ ניתוח תמונה מכוסה. על-ידי ביצוע פרוטוקול זה, ניתן להשיג תמונות כימיות באמצעות תדירות הרומן המבוססת על מצלמת המשך חיים מבוססי-תחום. בהתאם ליישום, אלקטרואופטיקה מישורי יכול להיות מפוברק בגדלים שונים ועובי שכבה של שכבת החיישן החל חזק 50-100 יקרומטר מישורי עבה בעובי של מספר עשיריות של סנטימטר מרובע כדי לכסות מיקרוסקופ כיסוי עם < 1 יקרומטר שכבות חיישן עבה⁶^,⁴⁰. הפוטנציאל של שיטה זו הוכח עם יישום מסוים, אבל הוא לא רק מוגבל O₂ הדמיה במפעל ריזודורים¹²^,²⁸.

שיטה זו יש מספר יתרונות כאשר לעומת שיטות הדמיה כימית טהורה המבוססת על עוצמה. לומינסנציה הדמיה של חיים לא, או לפחות הרבה פחות, מושפע תאורה מחוספס, עובי אלקטרואופטיקה מחוספס, צילום הלבנת²⁵. כמו כן, שיטה זו מונעת את השימוש בצבע התייחסות נוסף המשותף בהדמיה של טימטרי¹⁷^,³⁷. בהשוואה למערכות מבוססות חיים אחרות המבוססות על מערכות, כגון מצלמות בתחום הזמן הנפוץ מגודרת⁸^,²⁶, מערכת המצלמה הרומן ופרוטוקול הציג כאן יכול לספק תוצאות דומות. בפרסום האחרונות, המאפיינים האנליטיים של שתי מערכות אלה הושוו והוא נמצא כי התדר-התחום מבוסס על מערכת החיים מבוססי המצלמה היא לפחות להשוות את הזמן הופסק-תחום הפעילות הקדם⁸.

הצגנו את הפשוט ביותר O₂ אלקטרואופטיקה המורכב רק מחוון במטריצה פולימר. מלבד מספר רב אחרים אפשריים O₂ אינדיקטורים שעשויים לשמש תוספים ניתן לכלול, כלומר, פיזור סוכנים כגון TiO₂ או אבקת יהלום² כדי להגדיל את האות חיישן תוך הפחתת שקיפות של אלקטרואופטיקה. גם צבעים נוספים עשויים לשמש כדי לשפר את עוצמת האות באמצעות העברת אנרגיה⁴¹.

לייצור אלקטרואופטיקה מישורי, אנו ממליצים להשתמש בפער במכשיר ציפוי סכין של 75-120 יקרומטר כדי להניב עובי שכבת החיישן הסופי של סביב 7.5 כדי 12 יקרומטר לאחר אידוי הממס (סביב 10% הפער המשמש), כאשר באמצעות הרכב חיישן התיאור המתואר. זוהי פשרה טובה בין עוצמת האות, אשר ניתן לשנות על ידי טעינת צבע גבוה יותר, או על ידי בחירה של אינדיקטור וצבע התייחסות של בהירות גבוהה יותר, ואת זמן התגובה. עלייה בעובי השכבה גורמת לעלייה בזמן התגובה, כאשר טווח הזמן הנדרש עבור האנליטה להגיע לשיווי משקל תרמודינמי בשכבת החישה עם המדיה המקיפה מגביר¹².

אלקטרואופטיקה, כפי שמתואר כאן, מגיבים לשינויים ב-O₂ ריכוז בתוך כמה שניות¹⁷ תוך שהוא עדיין בעל אות האור חזק מספיק. ציפוי חיישן ultrathin עם זמני תגובה תת שנייה ניתן להבין עם ציפוי ספין⁶. אם התמיכה או המכשיר ציפוי סכין אינם מנוקים היטב, זה עלול לגרום לשכבות חיישן הומוגנית. כמו כן, כאשר הקוקטייל אינו הומוגנית לחלוטין או מוחל במהירות רבה מדי לאחר התפשטות מול המכשיר ציפוי כגון תוצאה לא רצויה ניתן לצפות. לכן, ייתכן שיהיה צורך בתרגול כדי להכין אופדים אופטימליים.

השיטה יכולה לשמש דגימות תמונה אשר ניתן לשים במגע קרוב אלקטרואופטיקה, כגון בעלי חיים ימיים מסוימים⁴², ביוילאמים⁶ ו קרקעות³¹ רק שם כמה. אנו מציגים התקנה עצמאית באמצעות מטרה, עם זאת, המצלמה יכולה בקלות להיות מצמידים למיקרוסקופ עבור הדמיה כימית ברזולוציה גבוהה⁴³.

בזמן שהתחום הזמני המבוסס על חיים הדמיה מופעלת הדיכוי של הרקע הזריחה²⁶, זה בעיה בעת שימוש בתדר חדש-מבוססי מערכת המחשבים המבוססת⁸. בשל רכישת תמונה רציפה, המצלמה הזאת יהיה להקליט כל הזריחה הרקע של המדגם שיכול להיות נרגש על ידי LED שנבחרו פולט בחלון ספקטרלי שנבחר כפי שהוגדר על ידי מסנן פליטה על המטרה המצלמה. הדבר יגרום לתקופת חיים נמוכה ככל הנראה, וכתוצאה מכך בקריאות שווא. במקרה שאתה עובד עם דגימות עם חופף משמעותי מהותי חופפים עם הריגוש O₂ חיישן ופליטה, חיוני להחיל בידוד אופטי נוסף על גבי אלקטרואופטיקה, על ידי ציפוי שכבה נוספת המכילה פחמן שחור²^,¹⁷. כך, רק לומינסנציה הנפלטת מן האופדה מישורי יגיע המצלמה. כדי לבדוק את האור ברקע תמונה ללא אלקטרואופטיקה ניתן לקחת, אשר באופן בלעדי להראות האור הפנימי של המדגם. ניתן גם להוסיף חומרים פיזור כגון TiO₂ או אבקת יהלומים²^,⁴⁴, כדי קוקטייל חיישן, כדי להגדיל את עוצמת האור של המחוון צבע. עם זאת, זה יכול גם להוביל מהיר יותר צילום הלבנת ו-TiO₂ הוא צילום זרז ידוע, אשר יכול לפגוע ביציבות^{photostability}לצבוע. היבט נוסף לשקול הוא אור הרקע. בעת הדמיה של תקופות חיים, יש להימנע מתאורת רקע באופן היעיל ביותר האפשרי. לכן, שיטת דימות זו מחייבת שההתקנה תוצב בסביבה חשוכה וכל מקור האור החיצוני צריך להיות מכובה זמנית במהלך רכישת תמונה.

לסיכום, הדמיה לכל החיים ההדמיה היא שיטת הדמיה כימית חזקה שניתן להתאים יישומים שונים רבים. פרוטוקול זה (ראה סעיף 1-5) מכסה את כל הצעדים החיוניים כדי ליצור תמונה O₂ ומשתמש בתדירות הגמישה ביותר לתחום הדמיה מערכת הגלגול החיים, אשר יכול להחליף את מצלמה הזמן הופסק מתחם המחשב עבור 2D O₂ דימות עם אלקטרואופטיקה מישורי.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לסופי לינדארד יאקובסן (אוניברסיטת קופנהגן) ולארס בורראשארד פדרסן (אוניברסיטת אורהוס) לקבלת סיוע טכני. מימון עבור מחקר זה הושג מענק סאפרה-Aude מתוך קרן מחקר עצמאית דנמרק (DFF-1323-00065B; MK), מענקי הפרויקט מקרן המחקר העצמאי דנמרק | מדעי הטבע (DFF-8021-00308B; MK) & מדעי הטכנולוגיה וההפקה (DFF-8022-00301B ו-DFF-4184-00515B; MK), הקרן הלאומית למחקר של דנמרק (DNRF136), ו-Poul Due ינסן קרן (KK).

Materials

Air pump with air stone and water pump	Local aquarium store
Chloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
DC4 silicone compound	Dow Corning GmbH	2793695
Gas mixer	Vögtlin Instruments GmbH	red-y compact meter GCM	This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices
Glass plates and aquaria	Local aquarium or hardware store
ImageJ Software	ImageJ		Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)
Knife-coating device	BYK-GARDNER GMBH byk.com	2021	This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 µm, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.
LED lamp, Reflector PAR38	Megaman	MM17572
LED LEDHUB	Omicon Laserage, Germany		Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential
LOCTITE AA 3494	Henkel AG & Co. KGaA	NA	Acrylic-based instant adhesive
NIS Elements AR Software	Nikon Inc		Software package used for image acquisition
pco.flim	PCO AG, Germany		Frequency domain based luminescence lifetime camera
platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP)	Frontier Scientific	PtT975	O₂ indicator
polyethylene terephthalate (PET) foil	Goodfellow	320-992-72	Such foils might also be found from other providers and serve as solid support
Polystyrene (PS)	Sigma Aldrich	9003-53-6	Polymer matrix
Schott RG610 filter	www.uviroptics.com		Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective
Vinyl electrical tape	Scotch, Super 33+	NA
Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor	delivered with the camera		Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount

References

Glud, R. N., Kühl, M., Kohls, O., Ramsing, N. B. Heterogeneity of oxygen production and consumption in a photosynthetic microbial mat as studied by planar optodes. Journal of Phycology. 35 (2), 270-279 (1999).
Moßhammer, M., Strobl, M., Kühl, M., Klimant, I., Borisov, S. M., Koren, K. Design and Application of an Optical Sensor for Simultaneous Imaging of pH and Dissolved O2 with Low Cross-Talk. ACS Sensors. 1 (6), 681-687 (2016).
Jensen, S. I., Kühl, M., Glud, R. N., Jørgensen, L. B., Priemé, A. Oxic microzones and radial oxygen loss from roots of Zostera marina. Marine Ecology Progress Series. , 49-58 (2005).
Larsen, M., Santner, J., Oburger, E., Wenzel, W. W., Glud, R. N. O2 dynamics in the rhizosphere of young rice plants (Oryza sativa L.) as studied by planar optodes. Plant and Soil. 390 (1-2), 279-292 (2015).
Brodersen, K. E., Koren, K., Moßhammer, M., Ralph, P. J., Kühl, M., Santner, J. Seagrass-Mediated Phosphorus and Iron Solubilization in Tropical Sediments. Environmental Science and Technology. 51, 14155-14163 (2017).
Kühl, M., Rickelt, L. F., Thar, R. Combined imaging of bacteria and oxygen in biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 73 (19), 6289-6295 (2007).
Sønderholm, M., et al. Tools for studying growth patterns and chemical dynamics of aggregated Pseudomonas aeruginosa exposed to different electron acceptors in an alginate bead model. npj Biofilms and Microbiomes. 3, 1-11 (2018).
Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S. M., Holst, G., Kühl, M. Luminescence Lifetime Imaging of Chemical Sensors – A Comparison between Time-Domain and Frequency-Domain Based Camera Systems. Analytical Chemistry. 91 (5), 3233-3238 (2019).
Brodersen, K. E., Koren, K., Lichtenberg, M., Kühl, M. Nanoparticle-based measurements of pH and O2 dynamics in the rhizosphere of Zostera marina L.: effects of temperature elevation and light-dark transitions. Plant, Cell & Environment. 39 (7), 1619-1630 (2016).
Zhu, Q., Aller, R. C., Fan, Y. High-Performance Planar pH Fluorosensor for Two-Dimensional pH Measurements. in Marine Sediment and Water. Environmental Science & Technology. 39, 8906-8911 (2005).
Murniati, E., Gross, D., Herlina, H., Hancke, K., Glud, R. N., Lorke, A. Oxygen imaging at the sediment-water interface using lifetime-based laser induced fluorescence (τLIF) of nano-sized particles. Limnology and Oceanography: Methods. 14 (8), 506-517 (2016).
Santner, J., Larsen, M., Kreuzeder, A., Glud, R. N. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils – a review. Analytica Chimica Acta. , 9-42 (2015).
Glud, R. N. Oxygen dynamics of marine sediments. Marine Biology Research. 4 (4), 243-289 (2008).
Revsbech, N. P., Jorgensen, B. B., Blackburn, T. H. Oxygen in the Sea Bottom Measured with a Microelectrode. Science. 207 (4437), 1355-1356 (1980).
Klimant, I., Meyer, V., Kuhl, M. Fiberoptic oxygen microsensors, a new tool in aquatic biology. Limnology and Oceanography. 40 (6), 1159-1165 (1995).
Glud, R. N., Tengberg, A., Kühl, M., Hall, P. O. J., Klimant, I., Holst, G. An in situ instrument for planar O2 optode measurements at benthic interfaces. Limnology and Oceanography. 46 (8), 2073-2080 (2001).
Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9, 348-360 (2011).
Glud, R., Ramsing, N., Gundersen, J., Klimant, I. Planar optrodes:a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).
Frederiksen, M. S., Glud, R. N. Oxygen dynamics in the rhizosphere of Zostera marina: A two-dimensional planar optode study. Limnology and Oceanography. 51 (2), 1072-1083 (2006).
Quaranta, M., Borisov, S. M., Klimant, I. Indicators for optical oxygen sensors. Bioanalytical Reviews. 4, 115-157 (2012).
Koren, K., Hutter, L., Enko, B., Pein, A., Borisov, S. M., Klimant, I. Tuning the dynamic range and sensitivity of optical oxygen-sensors by employing differently substituted polystyrene-derivatives. Sensors and Actuators B: Chemical. 176 (100), 344-350 (2013).
Borisov, S. M. Fundamentals of Quenched Phosphorescence O2 Sensing and Rational Design of Sensor Materials. Quenched-phosphorescence Detection of Molecular Oxygen: Applications in Life Sciences. , 1-18 (2018).
Wang, X., Wolfbeis, O. S. Optical methods for sensing and imaging oxygen: materials, spectroscopies and applications. Chemical Society Reviews. 43, 3666-3761 (2014).
Ehgartner, J., Wiltsche, H., Borisov, S. M., Mayr, T. Low cost referenced luminescent imaging of oxygen and pH with a 2-CCD colour near infrared camera. The Analyst. 139 (19), 4924 (2014).
Meier, R. J., Fischer, L. H., Wolfbeis, O. S., Schäferling, M. Referenced luminescent sensing and imaging with digital color cameras: A comparative study. Sensors and Actuators B: Chemical. 177, 500-506 (2013).
Holst, G., Kohls, O., Klimant, I., König, B., Kühl, M., Richter, T. A modular luminescence lifetime imaging system for mapping oxygen distribution in biological samples. Sensors and Actuators B. 51, 163-170 (1998).
Moßhammer, M., Brodersen, K. E., Kühl, M., Koren, K. Nanoparticle- and microparticle-based luminescence imaging of chemical species and temperature in aquatic systems: a review. Microchimical Acta. , 1-28 (2019).
Koren, K., Kühl, M. CHAPTER 7. Optical O2 Sensing in Aquatic Systems and Organisms. Quenched-phosphorescence Detection of Molecular Oxygen: Applications in Life Sciences. 1, 145-174 (2018).
Chen, H., Holst, G., Gratton, E. Modulated CMOS camera for fluorescence lifetime microscopy. Microscopy Research and Technique. 78, 1075-1081 (2015).
Franke, R., Holst, G. A. Frequency-domain fluorescence lifetime imaging system (pco.flim) based on a in-pixel dual tap control CMOS image sensor. Proceedings of SPIE 93281, Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues XIII. , 1-19 (2015).
Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science and Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
Schreml, S., et al. 2D luminescence imaging of physiological wound oxygenation. Experimental dermatology. 20 (7), 550-554 (2011).
Trampe, E., et al. Functionalized Bioink with Optical Sensor Nanoparticles for O2 Imaging in 3D-Bioprinted Constructs. Advanced Functional Materials. 1804411, 1804411 (2018).
Gouterman, M. Oxygen Quenching of Luminescence of Pressure Sensitive Paint for Wind Tunnel Research. Journal of Chemical Education. 74 (6), 697 (1997).
Fischer, L. H., et al. Referenced dual pressure- and temperature-sensitive paint for digital color camera read out. Chimie. 18 (49), 15706-15713 (2012).
Fabricius-Dyg, J., Mistlberger, G., Staal, M., Borisov, S. M., Klimant, I., Kühl, M. Imaging of surface O2 dynamics in corals with magnetic micro optode particles. Marine Biology. 159 (7), 1621-1631 (2012).
Koren, K., Jakobsen, S. L., Kühl, M. In-vivo imaging of O2 dynamics on coral surfaces spray-painted with sensor nanoparticles. Sensors and Actuators B: Chemical. 237, 1095-1101 (2016).
Carraway, E. R., Demas, J. N., DeGraff, B. A., Bacon, J. R. Photophysics and Photochemistry of Oxygen Sensors Based on Luminescent Transition-Metal Complexes. Analytical Chemistry. 63 (4), 337-342 (1991).
Klimant, I., Ruckruh, F., Liebsch, G., Stangelmayer, A., Wolfbeis, O. S. Fast response oxygen micro-optodes based on novel soluble ormosil glasses. Mikrochimica Acta. 131, 35-46 (1999).
Askaer, L., Elberling, B., Glud, R. N., Kühl, M., Lauritsen, F. R., Joensen, H. P. Soil heterogeneity effects on O2 distribution and CH4 emissions from wetlands: In situ and mesocosm studies with planar O2 optodes and membrane inlet mass spectrometry. Soil Biology and Biochemistry. 42 (12), 2254-2265 (2010).
Mayr, T., Borisov, S. M., Abel, T., Enko, B., Waich, K. Light Harvesting as a Simple and Versatile Way to Enhance Brightness of Luminescent Sensors. Analytical Chemistry. 81, 6541-6545 (2009).
Kühl, M., et al. Microenvironmental Ecology of the Chlorophyll b-Containing Symbiotic Cyanobacterium Prochloron in the Didemnid Ascidian Lissoclinum patella. Frontiers in microbiology. 3, 1-18 (2012).
Dalfen, I., Dmitriev, R. I., Holst, G., Klimant, I., Borisov, S. M. Background-Free Fluorescence-Decay-Time Sensing and Imaging of pH with Highly Photostable Diazaoxotriangulenium Dyes. Analytical Chemistry. 91 (1), 808-816 (2019).
Chatni, M. R., Maier, D. E., Porterfield, D. M. Evaluation of microparticle materials for enhancing the performance of fluorescence lifetime based optrodes. Sensors and Actuators B: Chemical. 141, 471-477 (2009).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Moßhammer, M., Scholz, V. V., Holst, G., Kühl, M., Koren, K. Luminescence Lifetime Imaging of O₂ with a Frequency-Domain-Based Camera System. J. Vis. Exp. (154), e60191, doi:10.3791/60191 (2019).