Optik sensör folyoları ile 2D O2 dağıtımlarının haritalama için yeni, frekans etki alanı parlaklık ömür boyu kamera kullanımını anlatıyoruz. Kamera sistemi ve görüntü analizi prosedürleri, su bitkilerinin rizosferinde O2 mikro ortamının görselleştirilmesi için sensör folyolarının hazırlanması, kalibrasyonu ve uygulanması ile birlikte açıklanmıştır.
Çözünmüş oksijeni (O2),2B’de yüksek uzamsal (< 50-100 μm) ve zamansal (< 10 s) çözünürlükte görüntülemek için bir yöntem tanımlıyoruz. Bu yöntem, frekans etki alanında parlaklık ömrünü görüntülemek için özel bir kamera sistemi ile birlikte O2 hassas Parlak sensör folyoları (düzlemsel optodlar) kullanır. Düzlemsel optodeler, O2-hassasgösterge boyasının bir polimer içinde çözülmesi ve karışımın bıçak kaplaması ile tanımlanmış bir kalınlıkta katı bir destek üzerine yayılması ile hazırlanır. Çözücü buharlaşma sonra, düzlemsel optode ilgi örneği ile yakın temas yerleştirilir – burada su bitki Littorella uniflorakökleri ile gösterilmiştir. Düzlemsel optod içindeki gösterge boyanın parlaklık ömründeki O2 konsantrasyonuna bağlı değişim, şeffaf taşıyıcı folyo ve akvaryum duvarının arka tarafı üzerinden özel bir kamera kullanılarak görüntülenir. Bu kamera, modüle edilmiş bir uyarma sinyali ile emisyon sinyali arasındaki faz açısındaki bir kayma yla parlaklık ömrünü (μs) ölçer. Bu yöntem, sinyal uyarma kaynağının boya konsantrasyonu veya yoğunluğundan bağımsız olduğundan ve sadece doğal olarak başvurulan bir parametre olan lüminesans bozunma süresine dayandığından, lüminesans yoğunluğu görüntüleme yöntemlerinden daha üstündür. Sonuç olarak, ek bir başvuru boyası veya diğer başvuru araçları gerekmez. Biz bitki rizosferlerin makroskopik O2 görüntüleme için sistemin kullanımını göstermek, ancak kamera sistemi de kolayca bir mikroskop ile birleştiğinde olabilir.
Tortular ve topraklarda çözünmüş gazların ve iyonların dağılımı ve dinamiği mikrobiyal solunum1,2veya bitki köklerinden radyal oksijen kaybı3,4,5gibi biyojeokimyasal süreçler hakkında önemli bilgiler sağlar ve mikropların kimyasal mikroortamı6,7, bitki rizosferleri5,8,9 ve hayvan yuvaları10, 11,12. Bu tür difüzyon sınırlı ortamlarda biyolojik ve kimyasal aktivite kimyasal yüzeyler veya biyojeokimyasal süreçlerin ürünlerinin dik gradyanlar oluşturabilirsiniz. Özellikle, O2 kullanılabilirliği biyojeokimyasal süreçler ve böylece biyoloji ve bir sistemin ekoloji üzerinde büyük bir etkisi vardır13. Bu nedenle, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlükte O2 konsantrasyonlarının analizi su ve karasal bilimlerde büyük önem taşımaktadır. İlk olarak, elektrokimyasal ve optik mikrosensörler14,15 bu önemli analit ölçmek için geliştirilmiştir. Daha sonra, 2 boyutlu (2D) düzlemsel optodlar ile O2 görüntüleme tanıtıldı12,16,17,18,19, hangi görüntüleme ve toprak ve tortularda heterojen O2 dağılımı nın niceleme sağladı.
Düzlemsel O2 optodes uygun bir polimer21içinde çözünmüş bir O2-hassas gösterge boya20oluşur. Gösterge boya belirli optik dalga boylarında heyecanlı ve parlaklık şeklinde gevşeme üzerine kırmızı kaydırılmış ışık yayan. O2varlığında , heyecanlı gösterge boya çarpışma üzerine O2 molekülüne enerji aktarabilirsiniz, çarpışma tabanlı lüminesans söndürme olarak adlandırılır22. Bu nedenle, parlaklık yoğunluğu yanı sıra parlaklık ömrü artan O2 konsantrasyonu ile azalır23. İdeal bir durumda yoğunluk ve yaşam süresindeki değişim, belirli bir konsantrasyonda Parlaklık yoğunluğunu veya yaşam sürelerini (I0; τ0) veya O2’nin varlığını (I, τ) kullanarak Stern-Volmer denklemini (denklem 1) takip eder [Q]. Stern-Volmer sabiti (Ksv),optodun O2’yekarşı duyarlılığıiçin bir ölçüdür; KSV sıcaklık ve basınç gibi çevresel değişkenlere bağlıdır.
(1)
O2 dağılımındaki ilgili değişiklikleri görselleştirmek için düzlemsel sensör folyosu üzerinden kamera sistemi ile bu tür değişikliklerin kaydedilmesi kullanılabilir. Başlangıçta basit parlaklık yoğunluğu tabanlı O2 görüntüleme18kullanılmıştır. Ancak, bu tür metodoloji, heterojen aydınlatma, uyarma kaynağı veya kameradaki dalgalanmalar ve düzlemsel optod içinde gösterge boyasının düzensiz dağılımı nedeniyle sonuçların güvenilirliğini tehlikeye sokan dış parazitlere karşı çok hassastır.
Bu sınırlamalardan bazıları, O 2 duyarlı gösterge boyasının,O2-göstergesinden farklıbir spektral aralıkta yayılan duyarsız bir referans boya ile düzlemsel optodun polimer tabakasında birlikte immobilize edildiği ratiometrik görüntüleme17,24için düzlemsel optodlar kullanılarak hafifletilebilir. İki spektral pencerede edinilen emisyon görüntülerine dayanarak, O2duyarlı emisyon sinyali referans sinyali ile bölünür ve yukarıda belirtilen parazitlere daha az yatkın bir oran görüntüsü oluşturur5,17. Bu yöntem, ideal olarak aynı uyarma kaynağı tarafından heyecanlanabilen, ancak kameranın başka bir spektral penceresinde (örneğin, bir RGB kameranın başka bir renk kanalında) farklı bir dalga boyunda (önemli bir spektral çakışma olmaksızın) yayan ikinci bir boyanın kullanılmasını gerektirir.
Alternatif olarak, O2 görüntüleme gösterge konsantrasyonu25’tekidüzensiz aydınlatma veya heterojenliklerden etkilenmeyen gösterge boyanın parlaklık ömründeki O2’yebağımlı değişimin ölçülmeye dayandırılabilir. İlk parlaklık ömür boyu o2 görüntüleme sistemleri bir kapı şarj lı cihaz (CCD) kamera sistemi26ile zaman etki alanı ölçümleri dayalı, bir darbeli uyarma kaynağı kullanılır ve parlaklık görüntüleri göstergesi 8 uyarma veya emisyon içinde tanımlanmış zaman aralıkları üzerinden alınır8,23,27. Bu görüntülerden, parlaklık ömrü belirlenebilir ve bir kalibrasyonda ilgili O2 konsantrasyonu ile ilişkili olabilir. Daha sonra, düzlemsel optoda karşı preslenmiş belirli bir örnek için parlaklık ömrü görüntüleri O2 konsantrasyonu karşılık gelen 2D dağılımı görüntüleri dönüştürülebilir. Bu sistem laboratuvar ve yerinde16,28,birçok uygulamada kullanılmıştır, ancak temel kapı-mümkün CCD kamera artık ticari olarak kullanılabilir.
Son zamanlarda, frekans-etki alanı8görüntüleri elde eden farklı bir parlaklık ömür boyu kamera sistemi, serbest bırakıldı. Sistem uyarma için sürekli olarak modüle edilmiş bir ışık kaynağına dayanır. Bu ya zaman alanında görüntü edinimi için kullanılan bir darbeli uyarma yerine bir sinüzoidal veya kare dalga olabilir. Bu modülasyon, o2 gösterge boyasının modüle edilmiş bir parlaklık salınımı ile sonuçlanır, bu da bir açı ile faz-shifted, φ, hangi gösterge boya parlaklık ömrüne bağlıdır (τ) (bkz. denklem 2).
(2)
Uyarma ve emisyon genliği arasındaki değişim (yani, modülasyon indeksi veya derinliği (genlik sabit parlaklık parçasıile bölünür)) arasındaki değişim de parlaklık ömrüne bağlıdır. Yani, bilinen bir modülasyon frekansı ayarlayarak kamera içinde özel CMOS görüntü sensörü başkabir yerde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ns içinde parlaklık ömrünü ölçmek mümkün 8,29,30. Çalışma prensibi hakkında genel bir kılavuz bulunabilir (aşağıdaki bağlantı https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8kullanılarak).
Aşağıdaki protokolde, biz 2D9,31suda tatlı su bitki Littorella uniflora kökleri etrafında O2 konsantrasyonu dağılımı görüntüleme için yeni kamera sisteminin kullanımını göstermektedir. Bu yöntemin hiçbir şekilde bu uygulamayla sınırlı olmadığını vurgulamak isteriz. Oksijene duyarlı optodlar veya sensör parçacıkları27 çeşitli görüntüleme yöntemleri ile birlikte tıbbi araştırmakullanılmıştır 32, biyobaskı33, basınca duyarlı boyalar için34,35, veya fotosentetik sistemleri incelemek için2,36,37, sadece uygulamanın birkaç diğer alanları isim.
Bu protokolde optode hazırlığından O2 görüntü analizine kadar tüm iş akışı ele alınmıştır. Bu protokolü izleyerek, kimyasal görüntüler yeni frekans-etki alanı tabanlı lüminesans ömür boyu kamera kullanılarak elde edilebilir. Uygulamaya bağlı olarak, düzlemsel optodlar sensör tabakasının çeşitli boyutlarda ve katman kalınlığında, santimetre karesantimetrenin birkaç onda birinden mikroskop kapak lı ve <1 μm kalınlığında sensör katmanları6,40arasında değişen katman kalınlığında imal edilebilir. Bu yöntemin potansiyeli belirli bir uygulama ile gösterilmiştir, ancak bitki rizosferlerinde O2 görüntüleme ile sınırlı değildir12,28.
Bu yöntem, saf parlaklık yoğunluğu tabanlı kimyasal görüntüleme yöntemleri ile karşılaştırıldığında çeşitli faydaları vardır. Luminescence ömür boyu görüntüleme değil, ya da en azından çok daha az, düzensiz aydınlatma, düzensiz optod kalınlığı etkilenen ve fotoğraf ağartma25. Ayrıca, bu yöntem oranmetrik görüntüleme17,37ortak ek bir referans boya kullanımını önler. Diğer yaşam boyu tabanlı kamera sistemleri ile karşılaştırıldığında, yaygın olarak kullanılan gated zaman-etki alanı kameralar gibi8,26, burada sunulan yeni kamera sistemi ve protokol karşılaştırılabilir sonuçlar sunabilir. Yakın tarihli bir yayında, bu iki sistemin analitik özellikleri karşılaştırıldı ve frekans-etki alanı tabanlı parlaklık ömür boyu kamera sistemi en azından durdurulan zaman etki alanı tabanlı selefi8karşılaştırılabilir olduğu bulundu .
Sadece polimer matristeki bir göstergeden oluşan en basit O2 optod’u sunduk. Birçok olası O2 göstergeleri yanı sıra20 bu katkı maddeleri kullanılabilir, yani, tio2 veya elmas tozu2 gibi saçılma ajanları sensör sinyalini artırmak için optod şeffaflığı azaltırken. Ayrıca ek boyalar enerji transferi41ile sinyal yoğunluğunu artırmak için kullanılabilir.
Düzlemsel optode imalatı için, tarif edilen sensör kokteyl bileşimini kullanırken, solvent buharlaşmasından sonra 7,5 ila 12 μm civarında son sensör tabakası kalınlığı nı (kullanılan boşluğun yaklaşık %10’u) vermek için 75 – 120 μm’lik bıçak kaplama cihazında bir boşluk kullanmanızı öneririz. Bu, daha yüksek boya yüklemesi veya daha yüksek parlaklık gösterge ve referans boyaları ve yanıt süresi seçilerek değiştirilebilen sinyal yoğunluğu arasında iyi bir uzlaşmadır. Katman kalınlığındaki artış tepki süresinin artmasına neden olur, çünkü analitin çevredeki ortamla algılama katmanında termodinamik dengeye ulaşması için gereken zaman aralığı12’yeçıkar.
Burada açıklandığı gibi optodeler, o2 konsantrasyonundaki değişikliklere birkaç saniye içinde tepkiverirler 17. Ultraince sensör kaplamaları ile saniyenin altında tepki süreleri spin kaplama6ile gerçekleştirilebilir. Destek veya bıçak kaplama cihazı iyi temizlenmemişse, homojen sensör katmanlarına neden olabilir. Ayrıca, kokteyl tamamen homojen olmadığında veya kaplama cihazının önüne yayıldıktan sonra çok hızlı uygulandığında böyle istenmeyen bir sonuç görülebilir. Bu nedenle, en iyi optodes hazırlamak için bazı uygulama gerekebilir.
Bu yöntem, optode yakın temas halinde konulabilir görüntü örnekleri için kullanılabilir, bazı deniz hayvanları gibi42, biyofilm6 ve toprak31 sadece birkaç isim. Biz bir amaç kullanarak bağımsız bir kurulum mevcut, ancak, kamera kolayca daha yüksek çözünürlüklü kimyasal görüntüleme için bir mikroskop birleştiğinde olabilir43.
Zaman etki tabanlı lüminesans ömür boyu görüntüleme arka plan floresan26bastırılması etkin iken, bu yeni frekans etki alanı tabanlı kamera sistemi kullanırken bir sorundur8. Sürekli görüntü edinimi sayesinde, bu kamera seçilen LED tarafından heyecanlanabilecek herhangi bir arka plan floresanını kaydeder ve seçilen spektral pencereye kamera hedefindeki emisyon filtresi tarafından tanımlandığı şekilde yayır. Bu görünüşte daha düşük bir ömür boyu ve sonuç olarak yanlış okumalar neden olacaktır. O2 sensör uyarma ve emisyon ile örtüşen önemli bir içfloresan floresan örnekleri ile çalışmak durumunda, karbon siyahı içeren ek bir tabaka kaplama tarafından optod üstüne ekstra bir optik izolasyon uygulamak esastır2,17. Böylece, sadece düzlemsel optod yayılan parlaklık kamera ulaşacaktır. Arka plan parlaklığını kontrol etmek için optode olmayan bir görüntü alınabilir, bu da sadece numunenin içsel parlaklığını gösterir. Gösterge boyanın parlaklık yoğunluğunu artırmak için sensör kokteyline TiO2 veya elmas tozu2,44gibi saçılma ajanları eklemek de mümkündür. Ancak, bu da daha hızlı fotoğraf ağartma yol açabilir ve TiO2 bilinen bir fotoğraf katalizörü, bir boya fotostabilite bozabilir41. Göz önünde bulundurulması gereken bir başka yönü de arka plan ışığıdır. Parlaklık yaşam ları görüntülendiğinde, arka plan ışığının mümkün olduğunca verimli bir şekilde kaçınılması gerekir. Bu nedenle, bu görüntüleme yöntemi kurulumun karanlık bir ortama yerleştirilmesini gerektirir ve görüntü edinimi sırasında herhangi bir dış ışık kaynağının geçici olarak kapatılması gerekir.
Özetle, parlaklık ömür boyu görüntüleme birçok farklı uygulamalara adapte edilebilir sağlam bir kimyasal görüntüleme yöntemidir. Bu protokol (bkz. bölüm 1 – 5) Bir O2 görüntüsü oluşturmak için gerekli tüm adımları kapsar ve 2D O2 görüntüleme için durdurulan devre arası kameranın yerine düzlemsel optodeler ile değiştirebilen şu anda en esnek frekans etki alanı parlaklık ömür boyu görüntüleme sistemini kullanır.
The authors have nothing to disclose.
Biz Teknik yardım için Sofie Lindegaard Jakobsen (Kopenhag Üniversitesi) ve Lars Borregaard Pedersen (Aarhus Üniversitesi) teşekkür ederiz. Bu çalışmanın finansmanı, Bağımsız Araştırma Fonu Danimarka’dan (DFF-1323-00065B; MK), Bağımsız Araştırma Fonu Danimarka proje hibe | Fen Bilimleri (DFF-8021-00308B; MK) & Teknik ve Üretim Bilimleri (DFF-8022-00301B ve DFF-4184-00515B; MK), Danimarka Ulusal Araştırma Vakfı (DNRF136) ve Poul Due Jensen Vakfı (KK).
Air pump with air stone and water pump | Local aquarium store | ||
Chloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
DC4 silicone compound | Dow Corning GmbH | 2793695 | |
Gas mixer | Vögtlin Instruments GmbH | red-y compact meter GCM | This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices |
Glass plates and aquaria | Local aquarium or hardware store | ||
ImageJ Software | ImageJ | Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html) | |
Knife-coating device | BYK-GARDNER GMBH byk.com |
2021 | This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 µm, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation. |
LED lamp, Reflector PAR38 | Megaman | MM17572 | |
LED LEDHUB | Omicon Laserage, Germany | Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential | |
LOCTITE AA 3494 | Henkel AG & Co. KGaA | NA | Acrylic-based instant adhesive |
NIS Elements AR Software | Nikon Inc | Software package used for image acquisition | |
pco.flim | PCO AG, Germany | Frequency domain based luminescence lifetime camera | |
platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP) | Frontier Scientific | PtT975 | O2 indicator |
polyethylene terephthalate (PET) foil | Goodfellow | 320-992-72 | Such foils might also be found from other providers and serve as solid support |
Polystyrene (PS) | Sigma Aldrich | 9003-53-6 | Polymer matrix |
Schott RG610 filter | www.uviroptics.com | Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective | |
Vinyl electrical tape | Scotch, Super 33+ | NA | |
Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor | delivered with the camera | Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount |