주파수 도메인 기반 카메라 시스템을 갖춘 O_2의 발광 평생 이미징

1. 평면 O2 광단의 제작 발광O2 지표 염료 백금 (II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-펜타플루오르페닐)-포르피린(PtTFPP) 및 100 mg의 폴리스티렌(PS)을 엽록소 1g에 용해하여 소위 ‘센서 칵테일’을 얻습니다.참고: 칵테일은 냉장고와 어둠 속에서 몇 시간 동안 닫혀 있는 가스가 단단한 유리 병에 넣어 보관할 수 있습니다. 깨끗한 먼지가없는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 호일 (용도에 따라 크기)을 물이나 에탄올 (70 %)의 도움으로 청소 유리 판에 고정하십시오. 필름(그림 1A)을참조하십시오. 세척된 나이프 코팅 장치(120 μm)를 호일에 놓고 유리 파이펫을 사용하여 장치 앞에 센서 칵테일의 라인을 적용합니다(도1B). 그런 다음 칼 코팅 장치를 PET 호일 위에 천천히 균일하게 드래그하여 칵테일을 고르게 펴립니다.참고: 모든 재료와 공구는 철저히 세척해야 하며, 제조는 연기 후드, 플로우 벤치 또는 점 흡입 장치 아래와 같은 먼지가 없는 환경에서 이루어져야 합니다. 최종 센서 호일에서 이질성을 피하기 위해 클로로폼이 빠르게 증발함에 따라 호일에 센서 칵테일을 적용한 다음 단계는 신속하게 수행해야 합니다. 완성된 평면O2-민감광을주변 공기에서 1시간 동안 건조한 다음 50-60°C에서 가열 캐비닛에서 밤새 도록 건조시키고, 용매 증발 후 최종 층 두께를 ~12 μm로 건조시키고, 생성된 광도를 암흑 속에서 저장한다(예를 들어, 종이 봉투에) 추가 사용시까지(도1C).참고 : 평면 O2 광도는 사용하기 전에 몇 달에서 몇 년 동안 건조하고 어둠 속에서 저장할 수 있습니다. 1-20 μm에 이르는 최종 층 두께는 충분한 발광 신호와 적절한 응답 시간을 통해 좋은 결과를 제공하는 것으로 입증되었습니다. 2. 라이조 샌드위치 챔버 96 % 에탄올로 두 개의 유리 판 (24.5 x 14cm2, 두께 : 4mm)을 청소하십시오. 첫 번째 유리 판 (즉, 후면 챔버 측)의 가장자리를 따라 현미경 슬라이드 (76 x 26mm2, 두께 : 1mm)를 접착제로 경화, 아크릴 기반의 인스턴트 접착제 (재료 표참조)를 사용하여 하나의 긴 가장자리를 열어 둡니다. 필요에 따라 유리 커터를 사용하여 현미경 슬라이드를 줄입니다.주의: 유리를 절단하면 날카로운 모서리가 발생할 수 있으므로 주의해서 취급해야 합니다.참고 : 현미경 슬라이드는 앞면과 뒷면 사이의 스페이서 역할을하며 뿌리와 식물 크기의 두께에 따라 여러 층의 현미경 슬라이드를 서로 위에 붙일 수 있습니다. 접착된 현미경 슬라이드 사이의 공간에 맞게 필요한 모양과 크기로 평면 광도를 잘라냅니다. 코팅된 면을 위쪽으로 향하게 하여 전면 유리 판의 안쪽에 놓고, 이에 대해 누를 때 관심 있는 샘플과 접촉할 수 있도록 합니다. 유리 판에 광호 박의 한 쪽 가장자리를 테이프로 붙이고 유리 판과 광도 호일 사이에 수돗물을 몇 방울 떨어뜨립니다(그림2A). 이 물방울의 호일을 천천히 낮추어 유리 표면에 곧게 펴줍니다. 센서 코팅의 긁힘을 피하면서 부드러운 조직을 사용하여 평면 광섬유와 유리 판 사이에 갇힌 기포를 조심스럽게 제거하십시오. 유리판을 건조하게 닦고 광섬유 호일의 남은 가장자리를 유리판에 테이프로 채우십시오(그림2B).참고: 물 속에서 적절한 접착력이 있는 테이프를 선택해야 합니다. 0.5 mm의 메쉬 크기를 사용하여 퇴적물을 체질합니다.참고: 메시 크기는 스페이서 두께의 절반보다 커서는 안 됩니다. 침전물을 균등하게 분배하고 평평한 유리 판을 사용하여 현미경 슬라이드 스페이서와 동일한 두께로 조정하십시오. 두 번째 유리 판이 챔버를 제대로 밀봉할 수 있도록 현미경 슬라이드의 상부 표면을 조심스럽게 청소하십시오. 현미경 슬라이드 표면에 실리콘 그리스를 바릅니다. 조심스럽게 기포의 형성을 피하면서 얇은 물 필름으로 퇴적물을 덮습니다. 조심스럽게 Littorella uniflora의 한 번의 싹을 씻고 퇴적물 위에 놓고 식물 잎이 위쪽 열린 면에서 튀어 나와 있습니다(그림 2D). 두 번째 유리 판을 부착된 퇴적물 위에 놓고 완강압을 가하여 광섬유를 식물 뿌리와 주변 퇴적물과 밀접한 접촉을 유도합니다.참고: 퇴적물 속에 갇힌 기포는 유리판을 기울이면서 제거할 수 있습니다. 클램프를 사용하여 유리 판을 함께 고정합니다(그림2E). 티슈 페이퍼로 바깥쪽 가장자리를 건조시면 됩니다. 뿌리 줄기 샌드위치의 전체 조립에 걸쳐 보습 잎을 유지 (예를 들어, 물 몇 방울의 빈번한 추가에 의해). 비닐 전기 테이프를 사용하여 뿌리 줄기 샌드위치 챔버를 조입니다. 모델링 점토로 가장자리를 밀봉하고 비닐 전기 테이프로 추가로 테이프(그림 2F).참고 : 침전물, 또는 두 번째 유리 판 사이에 침전물, 또는 퇴적물 입자가있는 경우, 챔버는 모공 물이 누출 될 수 로 재 조립되어야한다 (반복 단계 2.4 – 2.8). 불투명 한 플라스틱을 사용 하 여 뿌리-샌드위치를 커버 하지만 식물 잎 밖으로 튀어 나뭇잎에 대 한 호 일에 슬릿을 두고. 플라스틱 호일에 창을 잘라, 그래서 그것은 전개하여 실험을 열 수 있습니다. 고무 밴드(그림 2G)를사용하여 적응 시간 동안 창을 닫아 식물이 배양되는 동안 사진 표백으로부터 광석을 보호합니다.참고: 조류 의 성장은 잠재적으로 측정 된O2 농도를 방해 할 수 있으므로 여과 된 물, 사전 세척 된 실험 장비를 사용하고 형성 시 조류를 제거하여 이를 최소화하는 것이 좋습니다. 3. 라이조 샌드위치 챔버 배양 뿌리 줄기 샌드위치 챔버를 물 탱크 (32 x 7 x 28cm3)에약간 기울어진 위치에 놓고 평면 장편에 대한 뿌리 성장을 장려합니다. 식물 잎을 완전히 잠수하기에 충분한 물로 물 탱크를 채웁니다. 시간 제어 램프를 사용하여 식물의 적응을 위해 14 시간 빛, 10 h 다크 사이클을 설정합니다. 공기 석재 또는 물 펌프를 탱크에 놓고 물의 폭기와 혼합을 보장합니다(그림 2H). 4. 이미징 이미징 설정 뿌리 샌드위치 챔버에서 평면 광을 덮고 있는 플라스틱 호일을 제거합니다. 수족관 벽에 optode를 똑바로 유리 벽으로 챔버를 배치합니다. 수족관 벽에 뿌리 줄기 샌드위치 챔버를 눌러 스페이서를 사용합니다.참고 : 수족관 벽과 뿌리 줄기 샌드위치 챔버 벽의 전체 두께가 너무 두꺼워서는 안되지만 발광 이미징을위한 아쿠아 리아 벽의 유리 두께는 산란 된 빛의 감쇠를 증가시켜 공간 크로스 토크를 줄이기 위해 > 1cm를 사용하는 것이 좋습니다. 재료 인터페이스에서 광 산란을 최소화하기 위해 두 유리 벽 (동일한 내화 지수)에 동일한 재료를 사용하는 것이 중요합니다. 이 뿐만 아니라 흐린된 이미지로 이어질 것 이다12. 수족관 앞의 목표(재료 표참조)를 갖춘 주파수 도메인 기반 발광 수명 카메라를 배치하고 관심 영역(수생 식물 의 뿌리 인 리토렐라 유니플로라,평면 광원과 직접 접촉)(그림3).참고: 카메라를 랩 스탠드에 배치하여 카메라를 쉽게 높이 조정할 수 있습니다. 랩 스탠드의 위치를 표시하고 고정해야 합니다. 또한 실험 중 실수로 카메라가 움직이지 않도록 랩 스탠드에 카메라를 테이프로 녹화할 수 있습니다. 표시기 염료로 PtTFPP 이미징에 적합한 방출 필터를 나사 (재료 표참조) 카메라 목표에, 여기 소스에서 추론을 제거하기 위해.참고: 나사 온 필터는 이상적이지만 정사각형 필터는 적절한 어댑터와 함께 사용하거나 목표에 신중하게 테이핑하여 사용할 수도 있습니다. LED 여기 소스(재료 표 참조)를 카메라의변조 및 다크 게이트 출력에 연결합니다.참고 : 전자는 광원에 대한 변조 신호를 전달하고 후자는 이미지 센서의 이미지 판독 중에 빛을 끕습니다. LED 여기 소스와 카메라를 컴퓨터에 연결합니다. 배경 광은 전체 방을 어둡게 하거나 전체 설정에 조밀한 검은 천을 두어 이미지 판독 중에 최소화해야 합니다. 후자의 경우, 카메라의 가열을 피하기 위해 충분한 환기를 보장하는 것이 중요하다. LED 여기 소스에 라이트 가이드를 고정하고 관심 영역을 덮는 평면 광호 호일을 균일하게 비춥히 비춥히 비춥시하도록 배치합니다.참고: 사용된 LED 여기 소스에서는 3개의 상이한 LED(460 nm, 528 nm, 625 nm) 사이를 전환할 수 있으며, 그 강도는 제어 소프트웨어를 통해 조정할 수 있습니다. 설정 및 카메라 작동참고: 설명된 실험에서는 상용 소프트웨어 패키지의 수명 이미징전용 모듈과 함께 주파수 도메인 기반 수명 카메라를 사용했습니다(재료 표참조). 사용하기 전에 선택한 소프트웨어에서 카메라를 선택하십시오.참고: 소프트웨어 및 카메라 드라이버는 제조업체 지침에 따라 이미징하기 전에 설치해야 합니다. (실험을 시작하기 전에 다시 설치) LED 제어 소프트웨어를 열고 대기를 똑딱하여 적합한 LED (여기 : 528 nm)를 선택합니다. 필요에 따라 LED 강도를 설정합니다(여기서는 30%). LED가 외부 TTL에 의해 트리거되었는지 확인합니다. 이 작업은 LED에 대한 아날로그 및 동기화를 똑딱으로 수행됩니다.참고: 레이저 전력이 너무 높으면서 표시기 또는 기준 염료의 사진 표백이 가속화될 수 있기 때문에 LED 강도를 개별적으로 조정해야 합니다. 카메라에 초점을 맞추고 수동으로 목표의 조리개를 조정합니다(본 연구에서 사용 f = 2.8).참고 : 수족관 유리가 아닌 평면 광에 카메라를 집중하는 것이 중요합니다. 이것은 규모에 대한 눈금자가있는 이미지를 취하고 실제 통치자가 아닌 광도의 통치자의 그림자에 초점을 맞추어 보장 할 수 있습니다. 소프트웨어의 카메라 제어판 내에서 다음 매개 변수를 설정합니다. 출력 파형에 대한 사네 파; 추가 위상 샘플링(예); 8 단계 샘플, 위상 순서 반대, 탭 A + B 판독; 5 kHz 변조 주파수.참고: 이러한 매개 변수는 이미지 품질에 영향을 미치며 필요한 경우 변경할 수 있습니다. 카메라 제조업체는 개별 매개 변수에 대한 지침을 제공합니다(카메라 제조업체는 소프트웨어가 업데이트될 때마다 지침및 업데이트를 발표합니다). 실험 전에 참조 이미지를 찍습니다.참고: 교정 표준(알려진 수명(ns 또는 μs)이 있는 발광 염료)를 이미징하거나 LED의 반사광을 사용하여 수행할 수 있습니다. 후자의 경우, 방출 긴 패스 필터는 목표에서 제거되어야 하며 알려진 수명은 1ns로 설정할 수 있습니다. 정규화된 발광 강도 이미지에 대한 ROI 통계 판독(이 패널 의 하단)이 0.68-0.72 의 범위에 도달할 때까지 전용 이미징 소프트웨어의 캘리브레이션 섹션에서 노출 시간을 조정합니다.참고: 이제 참조 수명(예: 1ns)이 소프트웨어에 대한 입력으로 제공됩니다. 캡처 참조를 눌러 참조 측정 계열의 수집을 시작합니다.참고: 완료되면 참조 데이터가 저장되고 샘플에서 단일 또는 타임랩스 측정을 수행할 수 있습니다. O2 광안의 교정 평면 O2-민감한광단조각을 (작은) 유리 수족관에 배치합니다. 앞에서 설명한 대로 교정 챔버의 유리 벽에 평면 광섬유를 고정합니다(섹션 2.3 참조). 교정 수족관을 카메라 앞에 놓습니다. LED에 의한 조명도 보장하고 광구가 전체 시야를 채웁니다.참고: 평면 광형은 동일한 호일 조각이거나 실제 실험에 사용된 호일과 동일한 센서 칵테일로 만들어야 합니다. 실험에 사용된 것과 동일한 액체 매체로 수족관을 채웁니다.참고: 교정 및 실험에 서로 다른 매체를 사용하면 측정에 영향을 미칠 수 있습니다(예: 센서 응답 및/또는O2 용해도변경). 따라서, 교정은 실제 실험과 동일한 매체, 그리고 동일한 온도에서 이루어져야 한다. 온도의 변동은 발광 신호에 영향을 미치며 피해야 합니다. 그러나 온도를 안정적으로 유지하지 못하는 경우 O2-민감한광원(다중 점)을 서로 다른(관련) 온도에서 보정하고 값의 후속 재계산을 통해 온도 보상을 수행해야 합니다. 가스 혼합 장치를 사용하여 알려진O2 농도의 공기/N2 가스 혼합물로 물을 플러시하여 보정 수족관 내의O2 농도를 조절합니다. 충분한 시간 동안 (수족관의 유량과 크기에 따라 다름)에 의해 물이 사용 된 가스 혼합물과 잘 균형을 이루는지 확인하십시오.참고: 온도 보상(예: 광섬유 또는전기화학O2 센서 사용)으로 외부 보정O2 센서를 사용하여 교정 수족관의O2 레벨을 모니터링하는 것이 좋습니다. 교정 챔버에서 서로 다른O2 농도에서 일련의 이미지를 가져 가라.참고: 획득한 교정 데이터에 적절한 곡선 맞춤을 구현하기 위해서는 최소 5개의 서로 다른O2 농도를 측정해야 합니다. 0 hPa (항산소 조건)에서 측정 한 다음 특정 표시기 염료의 동적 범위에 다른 값을 배포하는 것이 중요합니다. 여기에서 우리는 폴리스티렌 매트릭스에 고정 O2-민감한 표시염료로 PtTFPP를 사용했다. 이미지는 0, 48, 102, 156 및 207 hPa에서 촬영되었습니다. 207 hPa는 주어진 된 의 성도 및 압력에서 100 % 공기 포화에 해당합니다. 샘플 이미징 샘플을 카메라 앞에 놓고 조명도 확인합니다. 식물의 발광 수명 이미지를 획득하기 직전에 공장(및 기타 모든 광원)에 대한 조사를 공급하는 광을 끄세요. 강도 이미지에 따라 수집 시간을 조정하여 신호가 과포화되지 않고 너무 약해서 수명 결정에서 노이즈(S/N) 비율로 양호한 신호가 발생하도록 합니다. 다양한 조명 조건(예: 라이트/어둡게)에 식물을 노출시키고 이미지 세트를 획득합니다. 구조 이미지를얻기 위해 방에있는 빛을 켭타.참고: 배경 광이 켜져 있으면 카메라가 사실적인 수명 이미지를 측정하지 않습니다. 그러나 강도 이미지는 이제 반투명 광단을 통해 보이는 전체 시야를 보여줍니다. 뷰 필드에서 눈금자 또는 모두와 함께 이미지를 가져 가서 나중에 수집된 이미지의 배율을 조정합니다. 5. 데이터 분석 카메라 제조업체에서 제공하는 매크로를 사용하여 전용 이미징 소프트웨어에서 위상 수명 및 강도 이미지를 직접 내보냅니다. 자유롭게 사용할 수 있는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 추가 이미지 분석을 수행합니다(재료 표참조). 이미지 분석 소프트웨어에서 교정의 위상 수명 이미지를 열고 측정 기능을 사용하여 전체 이미지의 평균을 결정합니다. 알려진O2 농도에 대해 측정된 수명을 플롯하여 교정 기능을 결정합니다(도4A). 모든 데이터에서 θ0/θ를 계산합니다(θ0은 O2가없는 상태에서 측정된 위상 수명입니다). 이러한 값을 알려진O2 농도와 비교하여 플로팅합니다(그림4B). 동적 충돌 담금질(수학식 3)38,39 [Q]가O2 농도인 경우, 단순화된 2사이트 모델을 사용하여 캘리브레이션 플롯에서 Ksv 및 f 파라미터를 결정합니다. 데이터 분석 소프트웨어에서 맞춤 함수를 정의한 다음 Ksv 및 f를 결정합니다. (3) 이미지 분석 소프트웨어에서 획득한 샘플 이미지를 열어 결정된 매개변수 Kv,f 및 θ0을사용하여 이미지수명을O2 농도로 변환합니다.참고: 대체 접근법으로 획득한 교정 단계 수명값(그림 4A)도직접 사용할 수 있습니다. 이 경우 곡선 맞춤 기능을 사용하는 지수 맞춤이 교정에 사용됩니다. 이미지 분석 소프트웨어에서 눈금자와 함께 이미지를 열고 측정 도구를 사용하여 알려진 거리를 측정합니다. 이 측정값을 설정 눈금 아래 전역 축척으로설정합니다.