使用基于频率域的摄像机系统的 O₂的发光寿命成像

1. 平面O2光大光大 将1.5毫克发光O2指标染料铂（II）-5，10，15，20-四基-（2，3，4，5，6-五氟乙烯）和100毫克聚苯乙烯（PS）在1克叶绿素中获得所谓的”传感器鸡尾酒”。注意：鸡尾酒可以在封闭的、气密的玻璃瓶中保存几个小时，在冰箱和黑暗中，直到进一步使用。 在水或乙醇的帮助下，在清洁的玻璃板上修复清洁、无尘聚乙烯对苯二甲酸酯 （PET） 箔（取决于应用大小）薄膜 （图 1A） 将清洁的刀涂层装置（120 μm）放在铝箔上，并用玻璃移液器在设备前面涂上一条传感器鸡尾酒（图1B）。然后，将刀涂装置缓慢且均匀地拖动到 PET 箔上，均匀地将鸡尾酒均匀地铺开。注：所有材料和工具都必须彻底清洁，制造应在无尘环境中进行，如抽油烟机、流动台或点吸装置下方。为了避免最终传感器箔中的异质性，在氯仿快速蒸发时，应迅速完成传感器鸡尾酒在箔上应用的步骤。 在环境空气中干燥成品的平面 O2-敏感光片 1 小时，然后在加热柜中以 50-60 °C 过夜，在溶剂蒸发 12 μm 后形成最终层厚度。 在黑暗中（例如，在纸信封中）存储产生的光片，直到进一步使用（图 1C）。注：平面O2光片可在使用前干燥和黑暗中储存数月至数年。最终层厚度范围为1-20μm，已证明具有良好的效果，具有足够的发光信号和足够的响应时间。 2. 瑞佐三明治室 用96%乙醇清洁两块玻璃板（24.5 x 14厘米2，厚度：4毫米）。 使用可固化的丙烯酸即时胶粘剂（见材料表）在第一玻璃板边缘（即后腔室侧）上粘附显微镜玻片（76 x 26 mm2，厚度：1 mm），同时留下一个长边。根据需要使用玻璃切割机缩短显微镜幻灯片。注意：切割玻璃可能会导致锋利的边缘，应小心处理。注：显微镜滑动器在正面和背面之间充当垫片，根据根部厚度和植物大小，多层显微镜幻灯片可以相互粘合。 将平面光电切成所需的形状和尺寸，以适合胶合显微镜幻灯片之间的空间。将其放在前玻璃板内侧，涂层侧朝上，以便在压上时与感兴趣的样品接触。 将光片箔的一边绑在玻璃板上，在玻璃板和光片箔之间加入几滴自来水（图2A）。慢慢降低这些水滴上的箔，使其在玻璃表面上伸直。 使用软组织小心地去除夹在平面视板和玻璃板之间的气泡，同时避免刮伤传感器涂层。将玻璃板擦干，并将光片箔的剩余边缘粘在玻璃板上（图 2B）。注：应选择在水中具有适当附着力的胶带。 使用0.5毫米的网状尺寸筛分沉淀沉积物。在第一玻璃板上放置一勺湿沉积物（图2C）。注： 网格大小不应大于垫间隔厚度的一半。 均匀分布沉淀物，并使用平板玻璃板将其调整到与显微镜滑动垫片相同的厚度。仔细清洁显微镜滑片的上表面，以确保第二个玻璃板正确密封造型室。 在显微镜滑动表面涂抹硅润滑脂。用薄水膜覆盖沉积物，同时小心避免形成气泡。 小心地洗一次利托雷拉单体，并将其放在沉积物上，植物叶子从上部开放侧伸出（图2D）。 将第二块玻璃板（与光片相连）放在沉积物上，施加温和压力，使光片与植物根部和周围沉积物紧密接触。注：通过倾斜玻璃板，同时将它们组合在一起，可以去除沉积物中捕获的气泡。 使用夹子将玻璃板固定在一起 （图 2E）。用纸巾擦干外边缘。在整个根茎三明治的组装过程中保持叶子的滋润（例如，经常加入几滴水）。 使用乙烯基电气胶带拧紧根茎夹层。用建模粘土密封边缘，并额外用乙烯基胶带胶带胶带将其胶带（图2F）。注：如果沉积物中有许多气泡，或垫片显微镜玻片和第二玻璃板之间的沉积物颗粒，则应重新组装腔室，因为孔隙水可能会泄漏（重复步骤 2.4 – 2.8）。 使用不透明的塑料覆盖根佐三明治，但在箔片中留下一条狭缝，让植物叶子粘出来。在塑料箔中切开一个窗口，以便通过展开来打开用于实验。在适应期间使用橡皮筋（图2G）关闭窗口，在植物孵育时保护光光剂免受照片漂白。注：由于藻类生长可能会干扰O2浓度的测量，我们建议尝试尽量减少它，通过使用过滤水，预清洁的实验设备和去除藻类形成。 3. Rhizo-三明治室孵育 将 rhizo-三明治室放在水箱 （32 x 7 x 28 cm3）中，放在稍微倾斜的位置，以鼓励根生长对平面光。 给水箱注水，使植物叶子完全浸没。 使用时间控制的灯建立 14 小时光、10 小时暗循环，使工厂适应。在水箱中放置空气石或水泵，以确保水的通气和混合（图2H）。 4. 成像 成像设置 取出覆盖在根佐-三明治室中的平面光片的塑料箔。用玻璃墙将房间与光片直立在水族馆壁上。使用垫垫将 rhizo-三明治室按在水族馆的墙壁上。注：水族馆壁的整体厚度加上根佐夹层室壁不应太厚，但是，建议使用 > 1 cm 进行水族壁的玻璃厚度，以便通过增加散射光的衰减来减少空间串扰。重要的是，对两个玻璃墙使用相同的材料（相同的耐火性指数），以尽量减少材料界面上的光散射;因为这将导致图像模糊以及12。 将装有目标（参见材料表）的基于频域的发光寿命相机放在水族馆和感兴趣的区域（与平面视光直接接触的水生植物Littorella 单体植物的根） （图 3）。注： 摄像机可能放置在实验室支架上，以便轻松调整摄像机的高度。实验室支架的位置应标记并保持固定。此外，可以将摄像机连接到实验室支架，以避免在实验期间意外移动摄像机。 在摄像机目标上拧下合适的发射滤光片，用于将 PtTFPP 成像为指示染料（参见材料表），以去除激发源中的推论。注： 螺钉式过滤器是理想的，但方形滤波器也可以与适当的适配器一起使用，或者小心地将它们连接到目标。 将 LED 激励源（参见材料表）连接到摄像机的调制和暗门输出。注： 前者提供光源的调制信号，而后者在图像传感器的图像读出期间关闭光。将 LED 激励源和摄像机连接到计算机。在图像读出过程中，背景光线应最小化，要么使整个房间变暗，要么在整个设置上铺上浓密的黑色布。在后一种情况下，必须确保有足够的通风，以避免摄像机加热。 将光导线固定在 LED 激励源中，并将其定位为均匀地照亮覆盖感兴趣区域的平面光片箔。注：在用过的 LED 激励源中，可以在 3 个不同的 LED（460 nm、528 nm、625 nm）之间切换，其强度可通过控制软件进行调整。 设置和摄像机操作注：对于所述的实验，我们在商用软件包中使用基于频域的终身相机与用于终身成像的专用模块（参见材料表）。 使用前在所选软件中选择相机。注：在按照制造商指南进行成像之前，需要安装软件和摄像机驱动程序。 打开 LED 控制软件（在开始实验之前再次安装），然后通过勾选待机来选择合适的 LED（此处：528 nm）。根据需要设置 LED 强度（此处为 30%）。确保 LED 由外部 TTL 触发;这是通过勾选模拟和同步LED来完成的。注：LED 强度需要单独调整，因为过高的激光功率会导致指示器或参考染料的加速光漂白。 对焦相机并手动调整目标的光圈（在本研究中使用 f = 2.8）。注意：将相机聚焦在平面视光片上，而不是放在水族馆玻璃上，这一点很重要;这可以通过使用标尺进行缩放，并聚焦于光标上的标尺阴影而不是实际标尺来确保。 在软件的摄像机控制面板内设置以下参数：内部调制源;输出波形的当因波;附加相位采样（是）;8相位样品，相位顺序相反，点击A+B读出;5 kHz 调制频率。注：这些参数会影响图像质量，如果需要，可以更改。相机制造商提供有关各个参数的指南（每当软件更新时，相机制造商都会发布指南和更新）。 在实验前拍摄参考图像。注：这可以通过成像校准标准（已知寿命（ns 或 μs）的发光染料）或使用 LED 的反射光来实现。在后一种情况下，需要从目标中去除发射长通滤波器，并且已知寿命可以设置为 1 ns。 调整专用成像软件校准部分的曝光时间，直到标准化发光强度图像的ROI 统计信息读出（位于此面板底部）在 0.68 – 0.72 的范围内。注： 现在，引用生存期（例如 1 ns）作为软件的输入给出。 按捕获参考开始采集参考测量系列。注：完成后，将存储参考数据，并可在样品上进行单时或时差测量。 O2光光的校准 将一块平面 O2敏感光片放置在（小）玻璃水族馆中。如前所述，将平面光电固定在校准室的玻璃壁上（参见第 2.3 节）。将校准水族馆放在摄像机前面。确保 LED 照明均匀，以及光片填满整个视野。注：平面光片应来自同一片箔，或与实际实验中使用的铝箔用的传感器鸡尾酒制成。 向水族馆注入与实验中使用的相同液体介质。注：使用不同的介质进行校准和实验会影响测量（例如，通过改变传感器响应和/或 O2溶解度）。因此，校准应在与实际实验相同的介质和相同温度下进行。温度的波动会影响发光信号，应避免。但是，如果温度不能保持稳定，则需要通过校准不同（相关）温度的 O2敏感光度（多点）以及随后重新计算值来进行温度补偿。 使用气体混合装置，使用已知 O2浓度的空气/N2气体混合物冲洗水，调整校准水族馆内的 O2浓度。确保水与用过的气体混合物充分平衡（取决于水族的流速和大小）。注： 我们建议使用具有温度补偿的外部校准 O2传感器（例如，使用光纤或电化学 O2传感器）监控校准水族馆中的 O2电平。 在校准室中以不同的 O2浓度拍摄一系列图像。注：应至少测量五种不同的 O2浓度，以便使曲线适合采集的校准数据。在 0 hPa（缺氧条件）下测量，然后将其他值分布到特定指标染料的动态范围内，这一点很重要。在这里，我们使用PtTFPP作为O2敏感指标染料固定在聚苯乙烯基质。以 0、48、102、156 和 207 hPa 拍摄图像;207 hPa 对应于给定盐度和压力下 100% 的空气饱和度。 映像示例 将样品放在摄像机前面，确保均匀照明。 在获得植物的发光寿命图像之前，关闭向工厂（和所有其他光源）提供辐照的光源。根据强度图像调整采集时间，确保信号在寿命确定时不会过度饱和或太弱，从而达到良好的噪声 （S/N） 比。 使植物暴露在不同的光照条件下（例如，光/暗），并获取一组图像。 打开房间的灯以获取结构图像。注： 当背景灯打开时，相机将不会测量逼真的寿命图像。但是，强度图像现在显示整个视野，就像通过半透明光片看到的一样。 在视野中使用标尺或类似图像拍摄图像，以便以后缩放获取的图像。 5. 数据分析 使用相机制造商提供的宏，直接从专用成像软件导出相位寿命和强度图像。 使用免费的图像分析软件执行进一步的图像分析（参见材料表）。 在图像分析软件中打开校准的相位寿命图像，并使用测量功能确定整个图像的平均值。根据已知的 O2浓度绘制测量寿命以确定校准函数（图 4A）。 从所有数据中计算+0/*（ +0是不存在 O2时测量的相位寿命）。将这些值与已知的 O2浓度（图 4B） 进行绘制。 从校准图中确定参数Ksv和f，使用简化的双位点模型进行动态碰撞淬火（方程 3）38，39其中 [Q] 为 O2浓度。在数据分析软件中定义拟合函数，然后确定 K sv和 f。 (3) 在图像分析软件中打开采集的样本图像，使用确定的参数Ksv、f和+0将图像寿命转换为 O2浓度。注：作为替代方法，也可直接使用采集的校准相位寿命值（图4A）。在这种情况下，使用曲线拟合函数的指数拟合用于校准。 在图像分析软件中打开下一个标尺的图像，并使用测量工具测量已知距离。在”设置比例”下将此度量设置为全局比例。