マウスの行動赤字の初期指標としての巣作り行動

すべての手順は、ジョージメイソン大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され、実験動物ケアの評価と認定によって定められたガイドラインに従っています。 1. 評価前の動物と考慮事項 このプロトコルでは、成人、9-12ヶ月齢のC57BL/6J(n=10)(ストック#000664)野生型マウスおよびAPOE e4マウス(n=11)をヘミツィゴウスJ20(ストック#006293)×ホモ接血APOE e4(ストック#012307)クロスから使用する。 ハウジングルームでは、適切な濃縮を有する同性のリターテを有するグループハウスマウス(例えば、このプロトコルのために、マウスは、走行ホイール、イグルー、および小さなナイロンチューおもちゃを提供した)。グループハウス4-6雌マウス、および356mm L x 485 mm W x 218 mm Hホームケージ内の4匹の雄。注:研究者は、マウスが入れ子の試験後に再導入されたときにケージメイトの攻撃を避けるために、入れ子の前および/または後に戦略を実装することを検討するかもしれません。このような戦略は、行動試験中の取り扱いにマウスをより良く順応させるための行動試験の前の日常的な取り扱いを含むが、これらに限定されないが、積極的なマウスを分離し、個別に収容する。ホームケージ20内のマウスの数を減らすか、ケージ内戦闘の重症度に応じて、創傷21等を観察した。 2. 部屋と入れ子のセットアップ 各マウスが 4 回の試行 (試用ごとに 1 つのマテリアル) を完了していることを確認します。順序効果を避けるために、各マウスの入れ子の材料の順序をランダム化します。 ケージを別のテストルームに用意します。環境条件(例えば、22.2 ~ 22.3°C、湿度45~47%、9:00 AM~9:00 PMの点灯)を記録し、試験全体で一貫性があり、ハウジングルームと同一です。食料と水のアドリビタムを提供します。 各マウスにランダムな識別 (ID) 番号または文字を割り当てます。ランダム識別子カードを 29.2 x 18.4 cm ケージに取り付けます。 元の動物ID/タグおよびその他の必要な身分証明書をコロニー記録に記録し、アシスタントと畜産スタッフが状況に盲目のままであることを確認します。 野生型およびトランスジェニックマウスが不適切に分離されないような試験室でケージの配置をランダムに注文する(すなわち、部屋の反対側、別々の棚など)。 ケージの底を十分に覆って入れ子材料を準備します。正方形、ねじれ、細断された紙の試験のために約100gのトウモロコシの寝具の乾燥重量を使用し、柔らかいコブ試験のための柔らかいコブ寝具の約100グラムを使用します。 ビーカーを使用してネスティング材料を分散させる場合は、コーンコブの寝具または柔らかいコブ寝具でビーカーを100mL以下に充填してください。 マウスをケージに取り込む前に、最初のネストマテリアルをシーケンスに配置します。このプロトコルは、(1)単一の押された綿の正方形、(2)単一の紙のねじれ、(3)柔らかいコブ寝具のみの100g(すなわち、追加の寝具やネスティング材料を追加しない)、および(4)2.5gの清潔な(インクなし)、細断された白いプリンタ用紙を5〜7cmのストリップに切断した。図 1に示すように、ネストマテリアルを分散します (ベースライン)。 図1:各材料のケージセットアップ。すべてのマウスは、合計4回の試験のために材料の各タイプで1回の試験を完了しました。コーンコブの寝具は、紙のねじれ、押された綿の正方形、細断された紙を含むケージの底全体を並べました。柔らかいコブの寝具は、マウスがコーンコブから小さな綿の正方形を分離することを奨励するためにケージ全体に均等に分散しました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 3. 入れ子試験 ライト サイクルの開始時 (午前 9:00 など) に、最初の入れ子試行を 1 日の同じ時刻に開始します。 マウスを含むホームケージを検査室に持ち込みます。ホームケージから各マウスを取り出し、既にケージに置かれた材料で割り当てられたネストケージに入れきます。ホームケージをハウジングルームに戻します。 マウスが24時間の間、邪魔されずに1つの試験を完了できるようにします。 最初の試験開始後24時間、試験室に戻る。 ケージのふたを慎重に取り外し、各マウスの巣を撮影し、写真に割り当てられたIDをキャプチャし、ケージの外の材料の外観を最小限に抑えます。注: マウスが巣から移動するのを待ってから、ケージから削除します。マウスがケージの中にいるが、巣から離れている間に巣を撮影することを強くお勧めします。撮影前にケージからマウスを取り外そうとすると、マウスが驚く原因になり、ネスト材料の上に移動し、分散する可能性があります。 ネストケージからマウスをそっと取り出し、一時的な保持ケージに入します。寝具と入れ子材料を処分し、寝具を交換し、シーケンス内の次のネスト材料を提供し、マウスをネストケージに戻します。 必要に応じて繰り返し、4回の試行すべてでスコアを獲得します。研究者は、このプロトコルで議論された代替材料を使用することに興味があるかもしれませんが、細断紙と付随する採点基準を使用することをお勧めします。 すべての試験が完了したら、マウスを自宅のケージに戻します。マウスに潜在的な攻撃的な行動がないか観察します。攻撃性は、古い野生型の雄で発生する可能性があります。注:このプロトコルの目的のために、マウスは生後約9~12ヶ月で1回試験した。ネストは、時間の経過とともにネスト能力の低下を文書化し、神経変性の可能性のある原因となる役割を実証するために、いくつかの年齢(すなわち、選択された株に依存して、選択された株に依存して)に行われるべきである。 4. 評価者間の信頼性のスコアリングと評価 研究に目が見えない少なくとも2人の個人に、各入れ子材料のベースライン画像を提供する。必須ではありませんが、スコアラーがネストの概念に精通していることを確認します。スコアラーをトレーニングする場合は、一連の例の巣(例えば、細断された紙の図2)を提供し、スコアラーに各タイプの材料(該当する場合)と得点基準を理解します。 次のスケール情報(Deacon, 2006 から適応)2を使用して、各巣を 1 ~ 5 のスケールで評価します。細断された用紙を使用したスコアリングの例として図 2を参照してください。 細断された紙や小さな正方形がケージ全体に散らばったままの場合、または綿の正方形またはねじれが手つかずのままであった場合は、1のスコアを割り当てます。 材料の一部が巣に組み立てられたが、材料の50%以上が巣の構築に使用されなかった場合に2のスコアを割り当てます(すなわち、散乱したまままたは元の材料の大部分は手つかずのままでした)。 顕著な巣が構築されたときに3のスコアを割り当てますが、いくつかの部分はまだ散らばっていました。 ほとんどすべての材料が巣に使用されたが、いくつかの材料が散乱したままであったり、巣の近くにあった場合は、4のスコアを割り当てます。 すべてのマテリアルを使用して識別可能な巣を作成するときに、スコア 5 を割り当てます。注:スコアラーは、スコアリング手順中の疲労やバイアスを避けるために、休憩を取り、ベースラインの写真を再訪する必要があります。スコアラーは、バイアスを避けるために互いにスコアを話し合うべきではありません。スコアラーは、スコアが完了した後、またはスコアを変更するためにさらに議論が必要な場合は、クラス内相関(ICC)の問題を解決する可能性があるスコアについて話し合う必要があります。クラス内相関は、セクション 4.2 に示す手順を使用して実行されます。 図2:細断紙の基準を用いたスコアリングの例としては、好ましい材料である。左から右へ: 1 – 細断された紙は手つかずのままでした。2 – 紙の一部は巣に組み立てられましたが、ほとんどの部分は散乱したままでした。3 – 顕著な巣が構築されましたが、いくつかの部分がまだ散らばっていました。4 – ほとんどの部分は、巣のために使用されましたが、いくつかの部分は、巣の近くに散らばっていました。5 – すべての部分は、巣を作るために使用されました.写真では、動物の割り当てられた番号が盲目にならないように示されています。カードの色はランダムです。研究者は、ネズミが巣を分散させる可能性があるマウスを驚かせるために、マウスがケージに残るようにする必要があります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 各材料の各スコアラーのスコアが別々の列に入り込まれるようなデータファイルを収集して入力し、フォーマットします。注:補足ファイル1を使用する場合、この分析のためのコーディングスクリプトは、無料のオープンソースソフトウェア(例えば、RStudioのirrパッケージ)22、23を必要とすることを注意してください。このスクリプトは、ヘッダーとサブジェクト変数 (つまり、一番上の行と動物の文字) を削除して、クラス内相関 (ICC) を実行します。スクリプトを実行して、双方向の合意を実行し、コードの区切られたセクションを強調表示し、Ctrl + Enter または Command+ Enter を押すことによって ICC を平均的に測定します。 ICC を既存の基準24、25、26と比較します。通常、0.80 を超える ICC 値は、高い評価者間の信頼性に対応し、特定の時点で平均化されるスコアを正当化します (補足ファイル 2)。 評価者内の信頼性に関して同じ ICC 基準を使用します。注意:スコアラーは、最初の評価の1週間以内に同じ撮影された巣を獲得する必要があります。ICC が低い場合は、データが歪んだり、null の結果が生成されたりする可能性があるため、データの平均化に注意してください。ICC値が低い場合、(1)得点者に対する追加トレーニングが必要な場合、(2)得点者が巣のスコアの推論を議論する必要がある場合、(3)スコアに関する判断を行うために別の独立した校閲者が必要な場合がある、または(4)イントラレータ信頼性を評価する必要がある場合があります。評価者の信頼性が低い場合は、追加のトレーニングまたは別のスコアラーが必要になる場合があります。 5. 統計的考慮事項 必要に応じて、統計分析を行います。正規性の仮定に違反せず、マウスごとに複数の材料を使用するデータ(すなわち、被験者内効果)の場合は、分散の混合分析(ANOVA)を使用します。 補足ファイルとして提供されるコードを使用する場合は、スクリプト27、 28、29、30で指定されている追加のアドオン パッケージをダウンロードしてください。 指定されたスクリプトを使用して ANOVA を混在させる場合は、スクリプトを実行してワイドフォーマットのデータ ファイルを長い形式に変換します (つまり、列間で繰り返される変数ではなく、セルを [行間で繰り返し] に変換します)。この原稿には、データファイルをワイドフォーマットから長い形式に変換する方法を示すデータファイルの例が含まれています。 スクリプトで指定されているように、混合分散分析を実行します。Mauchlyの球状のテストに違反した場合は、温室-ガイザー補正などの補正因子を実装してください。 コーディング スクリプトで指定されているように、2 つ以上のレベルを持つ因子間の相違点を調べるために必要なポストホック テストを実行します。この例では、Bonferroni ポストホック テストを実施して、さまざまな種類のネスト材料を比較します。注: 1 つのネスト マテリアルのみを使用する場合は、被験者内因子を組み込まない必要があります。ただし、複数の時点でデータを収集する場合は、これらの繰り返しメジャーを、被験者内因子のレベルであるかのように組み込みます。注:いくつかのケースでは、野生型マウスは完璧なスコアを持っている可能性があり、したがって、非正規分布2につながる天井効果を示します。データを分析する際に、適切な統計検定(例えば、中心傾向と分散の代替手段を用いて非パラメトリック検定)、正規化方法、または堅牢なアプローチ(繰り返し測定のための混合効果モデリング)を検討してください。