Il comportamento dell'edificio Nest come indicatore precoce dei deficit comportamentali nei topi
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per quantificare il comportamento di costruzione del nido nei topi, che è noto per essere alterato in diversi disturbi e malattie neurologiche. Questo protocollo esamina l’utilità di quattro materiali e offre l’opportunità di quantificare l’accordo sui tassi nel punteggio, migliorando la validità e l’affidabilità del saggio.
Abstract
La costruzione del nido è un comportamento innato nei roditori maschili e femminili, anche se allevati in ambienti di laboratorio. Come tale, molti ricercatori forniscono roditori materiali sintetici e/o naturali (come spago, tessuto, cotone, carta e fieno) come misuratore del loro benessere generale e come valutazione ausiliaria per prevedere il possibile declino della cognizione. In genere, le modifiche nei comportamenti di annidamento, ad esempio la mancata creazione di un nido, indicano una modifica nella salute o nel benessere. Inoltre, il comportamento di nidificazione è sensibile a molte sfide ambientali e fisiologiche, così come molte mutazioni genetiche alla base degli stati della malattia patologica. Il protocollo seguente descrive un paradigma di comportamento di annidamento che esplora l’utilizzo di quattro tipi di materiale di nidificazione. Inoltre, il protocollo utilizza correlazioni intraclassi per dimostrare che l’affidabilità inter-rater è maggiore quando i nidi sono costruiti in carta triturata rispetto ad altri materiali di nidificazione comuni come quadrati di cotone, torsioni di carta e pannocchia morbida biancheria da letto e coperte. La metodologia scelta e le considerazioni statistiche (cioè la correlazione intraclasse) per questo saggio possono essere interessanti per coloro che conducono esperimenti valutando la qualità della vita dei topi.
Introduction
La costruzione del nido è un comportamento innato in molti animali come uccelli, pesci, roditori e grandi scimmie, e sta attirando più attenzione per la sua potenziale utilità nello studio di malattie neurologiche e disturbi caratterizzati da un benessere diminuito e attività della vita quotidiana1. I topi, sia maschi che femmine, costruiscono nidi di dimensioni simili per scopi riproduttivi, conservazione del calore e riparo; ancora più importante, continuano a farlo anche se allevati nelle impostazioni di laboratorio2. Hess, Petrovich e Goodwin3 sostengono che gli stimoli biologicamente appropriati sono fondamentali per indurre comportamenti biologicamente appropriati come la nidificazione; tuttavia, una varietà di materiali naturali e artificiali, come fieno, canapa, spago di cotone, strisce di carta, palline dentali di cotone e quadrati di cotone pressati, sono stati utilizzati per valutare il comportamento di costruzione del nido2. I cambiamenti in questi comportamenti di nidificazione (cioè, la mancata creazione di un nido dal materiale fornito) in genere indicano un cambiamento nella salute o nel benessere. Nella maggior parte dei casi, la mancanza di costruzione di nidi è attribuita a diversi fattori che influiscono negativamente sul benessere. Tali esempi che hanno tutti effettivamente diminuito la qualità della costruzione del nido nei topi includono gli estremi di temperatura; stimolazione dolorosa; malattie e infezioni indotte; mutazioni genetiche; e lesioni cerebrali nelle aree preoptice mediali, setto, e ippocampo4,5,6.
Il morbo di Alzheimer è una malattia neurodegenerativa progressiva caratterizzata da perdita di tessuto cerebrale, accumulo di placche extracellulari amiloidi-z e grovigli neurofibrillari intracellulari composti microtubuli iperfosforili proteine, tau7. Inoltre, il morbo di Alzheimer è caratterizzato, in particolare, da deficit nell’apprendimento e nella memoria e compromissione delle attività della vita quotidiana. Nei topi, le attività della vita quotidiana sono comunemente esaminate tramite la ruota circadiana8,9,10,11, anche se nuove alternative, come la nidificazione, stanno crescendo in popolarità. La nidificazione ha dimostrato di essere sensibile alle manipolazioni (ad esempio, mutazioni genetiche, fattori di stress ambientale) che sono state identificate come fattori di rischio e/o cause del morbo di Alzheimer. Come tale, la nidificazione può essere utilizzata come un saggio aggiuntivo o complementare in molti ceppi murini che modellano quelle caratteristiche del morbo di Alzheimer. Ad esempio, Diacono e colleghi12 hanno misurato la costruzione di nidi di topi Tg2576 con la proteina precursore dell’amiloide svedese (APPswe) e le mutazioni genetiche della presenilina 1 (PS1). La qualità dei nidi costruiti da topi Tg2576 ospitati in gruppo era significativamente peggiore rispetto ai controlli wildtype sia a 3 che a 12 mesi di età. In accordo con questi risultati, Filali et al.13 hanno riferito che i topi maschi APPswe/PS1 ospitati in modo singly sono stati dati due pezzi di 5 x 5 cm di cotone costruiti nidi significativamente più poveri come valutati su una scala da 1 a 5 (1 nido non toccato, 5 – un nido quasi perfetto). I topi transgenici costruivano costantemente nidi peggiori a 6, 9 e 12 mesi di età rispetto alle loro controparti wildtype, e in alcuni casi, i topi Appswe/PS1 non riuscirono completamente a costruire un nido con il cotone fornito.
Ricerche precedenti del nostro laboratorio hanno dimostrato che i topi wildtype C57BL/6J costruiscono nidi significativamente migliori dai quadrati di cotone rispetto ai topi CRND8 e CRND8/E49. Tuttavia, la maggior parte degli esperimenti che utilizzano quadrati di cotone pressati sembrano essere variabili, con topi selvatici che non mostrano punteggi alti attesi rispetto ai topi transgenici che dovrebbero mostrare punteggi molto bassi nella nidificazione2, che possono in parte portare a un mancanza di differenze nei parametri stimati (cioè differenze mediche) e di rilevanza statistica. La mancanza di differenze può essere dovuta in parte all’invecchiamento inadeguato dei topi o al tempo assegnato per la nidificazione. In alternativa, il materiale di nidificazione può essere una sfida aggiuntiva, con conseguente maggiore variabilità dovuta alle preferenze metodologiche dei ricercatori nella quantità e nel tipo di materiale, che può anche interagire con la deformazione del topo. Ad esempio, Robinson-Junker e colleghi14 hanno fornito materiale da letto trasformato o non lavorato di diverse dimensioni (ad esempio, piccoli o grandi fiocchi) ai topi C3H/HeNCrl e ai topi BALB/cAnNCrl, che sono comunemente osservati, rispettivamente, come poveri e forti costruttori di nidi. Quando sono stati forniti lenzuola non lavorati, i topi C3H hanno costruito nidi meno complessi, ma simili nei nidi di qualità rispetto a quelli dei topi BALB/c. Allo stesso modo, Martin e colleghi15 hanno confrontato la complessità del nido di diversi materiali di nidificazione dati ai topi dei cervi, un lontano parente delle specie Mus musculus che hanno differenze evolutive distinte (cioè, più probabilità di scavare negli alberi e sottobosco e sono più attivi in cattività), ma ricevono cure allevamento simili a quelle dei comuni topi di laboratorio e costruiscono nidi da qualsiasi materiale morbido e fibroso disponibile16,17,18. Femmine e allevatori con cuccioli nella gabbia di casa costruiti nidi più complessi rispetto ai maschi, e gli autori suggeriscono che queste differenze comportamentali possono essere dovute a cambiamenti associati nelle concentrazioni di progesterone nei topi dei cervi15. Ancora più importante, i topi costruirono nidi più complessi composti da carta marrone seguiti da quadrati di cotone e cilindri di cotone, e i nidi meno complessi sono stati costruiti con carta bianca e quadrati di mini-cotone dispersi.
Nonostante la crescente popolarità della nidificazione, vengono discusse minimamente considerazioni riguardanti pratiche scientificamente valide, convenienti e sensibili al tempo. Date le suddette sfide metodologiche ed economiche, questo protocollo indaga l’utilità di diversi materiali di nidificazione – quadrati di cotone, torsioni di carta, carta triturata e biancheria da letto elaborata – nel comportamento di nidificazione. In particolare, abbiamo fornito tutti i materiali di nidificazione sia ai controlli wildtype C57BL/6J invecchiati che ai topi APOE e4 del morbo di Alzheimer al fine di studiare qualsiasi potenziale genotipo mediante interazioni materiali nella qualità della nidificazione. Inoltre, l’esperimento ha cercato di valutare l’affidabilità inter-rater dei nidi costruiti con materiali diversi. Nel loro insieme, questo protocollo dimostra la superiorità di un materiale di nidificazione in questo campione – carta triturata – in termini di qualità del nido e accordo tra i marcatori, con l’intento di migliorare la validità e l’affidabilità del saggio di nidificazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
La nidificazione è un comportamento di roditore di importanza evolutiva ed è stata utilizzata per valutare l’attività della vita quotidiana e del benessere generale nei topi2. La facilità di condurre il test, la sua affidabilità e la sua validità facciale rendono la nidificazione un complemento pratico a molti test comportamentali come la tana, il ritmo circadiano e la toelettatura. Ma, man mano che la nidificazione diventa più comunemente utilizzata in laboratorio, le varie combinazioni per condurre, quantificare e interpretare la nidificazione aumentano. Di conseguenza, sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare le migliori procedure metodologicamente e praticamente valide per la nidificazione, in modo che la validità e l’affidabilità del saggio non siano sacrificate per i costi, il tempo di test e altre procedure che riducano l’onere dei test .
La qualità dell’edificio del nido è infatti sensibile al tipo di biancheria da letto fornita e al genotipo. Nel complesso, i topi wildtype hanno costruito nidi significativamente migliori rispetto ai topi APOE e4 indipendentemente dal materiale di nidificazione; tuttavia, sia i topi wildtype che APOE e4 costruiscono nidi di qualità significativamente più alti dalla carta triturata rispetto agli altri tre materiali di nidificazione. Altri studi forniscono prove corroboranti per quanto riguarda la carta triturata: topi costruiti nidi più complessi da strisce di carta triturate che con quadrati di cotone pressato, tessuto e biancheria da letto di pioppo33. Inoltre, i nidi costruiti con strisce di carta triturate sono stati valutati qualitativamente come più “naturalistici” di quelli di altri materiali, caratterizzati dalla forma del nido stesso e dall’altezza delle pareti intorno alla cavità del nido in per formare una cupola6,33. Come tale, la selezione di materiale adeguato per questo saggio è fondamentale al fine di osservare meglio il comportamento naturale in un ambiente relativamente controllato, cioè l’impostazione di laboratorio. Ancora più importante, anche se questo protocollo ha valutato la nidificazione una volta a 9 – 12 mesi di età, sottolineiamo che la nidificazione dovrebbe essere condotta in diverse età. La semplicità di questo protocollo permette di essere condotto più volte, idealmente prima dell’insorgenza di deficit che accompagnano la neurodegenerazione. Le misurazioni ripetute offrono l’opportunità di documentare il probabile ruolo causale della neurodegenerazione nella capacità di nidificazione diminuita.
La costruzione naturale del nido è stata dimostrata differire tra i topi di diversi ceppi di fondo34, e come tale, la qualità complessiva e la forma del nido possono differire non a causa del transgene di interesse, ma a causa della tensione di fondo. Ad esempio, gli antenati dei topi C57BL/6 erano considerati nidi “foro”, mentre gli antenati dei topi BALB/C erano considerati nidi “superficie”35. I topi sullo sfondo C3H o croci con questo ceppo, come l’ibrido C3H/He-C57BL/6 con E4 utilizzato in Graybeal et al.9 sono anche considerati poveri nidificatori; pertanto, i ricercatori dovrebbero prendere in considerazione l’uso di topi di controllo sullo stesso sfondo dei topi transgenici, che nel complesso migliorerebbero il ruolo diretto e causale dei transgeni, piuttosto che dello sfondo, nella neurodegenerazione e nei successivi deficit nel nido comportamento di costruzione.
Alcuni esperimenti spesso utilizzano un singolo marcatore per giudicare qualitativamente la complessità del nido; tuttavia, facciamo l’argomento per includere più marcatori, e, cosa più importante, marcatori ciechi a condizioni sperimentali. Attraverso questo approccio, abbiamo utilizzato tre marcatori ciechi indipendenti e una correlazione intraclasse per valutare l’accordo tra i marcatori, che, con la formazione di base, hanno prodotto elevate correlazioni intraclassi che erano indicative di elevata affidabilità inter-tasso e un forte accordo per quanto riguarda la qualità del nido. Inoltre, decine di nidi composti da carta triturata e quadrati di cotone avevano le più alte correlazioni intraclassi, un’indicazione di maggiore accordo e una maggiore coerenza tra i marcatori. Il forte accordo fornisce anche una giustificazione per calcolare la media dei punteggi multipli insieme, una strategia attuata a casaccio nella ricerca comportamentale. Anche se questa strategia richiede più individui e, presumibilmente, più tempo per segnare i nidi, riduce efficacemente il pregiudizio nelle valutazioni qualitative come la nidificazione.
I materiali di nidificazione utilizzati in questo saggio erano approssimativamente uguali nel prezzo ad eccezione della morbida biancheria da letto di pannocchia. La biancheria da letto commerciale per la nidificazione può essere economicamente intraprendente per alcuni sperimentatori; tuttavia, Martin et al.15 notare che i quadrati di cotone, rispetto ad altri materiali come la carta sgualcita, è uno dei materiali più costosi disponibili per l’acquisto. Ciò può essere dovuto alla facile disponibilità, stoccaggio e amministrazione, ma altri ricercatori possono optare per materiali altrettanto validi e affidabili, soprattutto se contestati da un gran numero di animali in una struttura, il numero di prove di nidificazione, le restrizioni di tempo per nidificazioni di punteggio e costi elevati delle gabbie. Pertanto, la carta triturata può essere un’opzione più fattibile e appropriata. Inoltre, l’acquisizione dei dati per il nostro metodo può essere condotta immediatamente (cioè, il punteggio di persona), anche se le fotografie dovrebbero essere altamente considerate al fine di registrare, salvare e ri-quantificare i nidi, se lo si desidera ai fini della valutazione tra e in-rater affidabilità in momenti successivi. Come notato, sottolineiamo con forza l’inclusione di più marcatori per pratiche di “test, ri-test” per valutare l’accordo, poiché queste procedure metodologicamente solide sono spesso trascurate.
In conclusione, riteniamo che la metodologia e le considerazioni statistiche (cioè la correlazione intraclasse) per questo saggio possano essere interessanti per esperimenti che valutano la qualità della vita, il benessere generale e le attività della vita quotidiana nei topi.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Kevin Quant, Mario Martinez e Edwin Portillo per aver segnato nidi, Rachel Barkey per aver assistito nella preparazione delle riprese, e Stephen Lippi e Deborah Neely per la revisione di questo manoscritto. Vorremmo anche ringraziare il Dipartimento di Psicologia per aver coperto i costi delle gabbie per questo esperimento, e i custodi del Krasnow Institute Animal Facility per il loro sostegno.
Materials
| Corncob bedding | Envigo | 7092 | 1/8 in bedding for cotton squares, shredded paper, and paper twist trials |
| Cotton Squares | Envigo | Iso-Blox | |
| Diamond Twists | Envigo | 7979C.CS | Paper twists used in protocol |
| Mouse – APOE4 e4 | Jackson Laboratories | #012307 | Homozygous APEO4 e4 mouse bred with hemizyous J20 mouse |
| Mouse – C57BL/6J | Jackson Laboratories | #000664 | Wildtype mouse for controls |
| Mouse – J20 | Jackson Laboratories | #006293 | Hemizygous mouse bred with the homozygous APOE e4 mouse to generate cross |
| Rstudio | R Core Team | V1.1.463 | Run with R version 3.5.3 (2019-03-11) — "Great Truth". Note: additional R Packages are included in provided code and can be installed from CRAN |
| Soft Cob | Envigo | 7087C |
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