JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Published: October 15, 2019
doi:
10.3791/60096
, , , , ,
1Institute of Physiology, Faculty of Medicine,University of Freiburg, Freiburg, Germany, 2Institute of Experimental and Clinical Pharmacology and Toxicology, Faculty of Medicine,University of Freiburg, Freiburg, Germany, 3Signalling Research Centres BIOSS and CIBSS, Freiburg, Germany, 4Logopharm GmbH, Germany

Summary

Yüksek çözünürlüklü complexome profilleme için mikrotom kullanan çok yönlü bir kriyoliking BN-MS protokolü sunulur.

Abstract

Proteinler genellikle diğer proteinlerle etkileşimler yoluyla biyolojik işlevleri uygularlar, ya dinamik protein derlemelerinde ya da koably oluşan komplekslerin bir parçası olarak. İkincisi zarif doğal poliakrilamid jel elektroforez (BN-PAGE) kullanılarak moleküler boyutuna göre çözülebilir. Bu tür ayırmaların hassas kütle spektrometresi (BN-MS) ile birleştirimi iyi kurulmuş ve teorik olarak biyolojik numunelerde çıkarılabilir kompleksin ayrıntılı olarak değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır. Ancak, bu yaklaşım oldukça zahmetli ve sınırlı karmaşık boyut çözünürlük ve duyarlılık sağlar. Ayrıca, uygulama bol mitokondriyal ve plastid proteinler ile sınırlı kalmıştır. Bu nedenle, proteinlerin çoğunluğu için, istikrarlı protein kompleksleri içine entegrasyon ile ilgili bilgi hala eksiktir. Burada preparatif ölçekli BN-PAGE ayrımı, kriyomikrotom dilimleme ile geniş jel şeritlerinin milimetre altı örneklemesi ve etiketsiz protein nicelemesi ile kütle spektrometrik analizinden oluşan complexome profilleme için optimize edilmiş bir yaklaşım sunulmuştur. Kritik adımlar için yordamlar ve araçlar ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bir uygulama olarak, rapor fare böbreklerinden bir çözünüren endozom zenginleştirilmiş membran fraksiyonu complexome analizi açıklar, toplam profilli 2.545 proteinile. Sonuçlar, hücre içi iyon kanalları gibi tek tip, düşük bolluk membran proteinlerinin yanı sıra glikozilasyon izoformları da dahil olmak üzere yüksek çözünürlüklü, karmaşık protein montaj desenleri tanımlamasını göstermektedir. Sonuçlar bağımsız biyokimyasal analizlerle uyumlu. Özetle, bu metodoloji protein (süper) komplekslerinin ve alt birim bileşiminin kapsamlı ve tarafsız bir şekilde tanımlanmasına olanak sağlayarak, herhangi bir protein kompleksinin stokiyometrisi, montaj ve etkileşim dinamiklerinin araştırılmasına temel teşkil etmektedir. biyolojik sistem.

Introduction

BN-PAGE ayrımı ilk olarak Majeran1 ve Wessels2 araştırma grupları tarafından BN-PAGE jel şeritlerinin manuel dilimlemesi kullanılarak LC-MS analizine (BN-MS) doğrudan bağdandı. Analizleri, sırasıyla bitki plastidleri ve HEK hücre mitokondrilerinden bilinen alt birim bileşimi ile bol membran protein kompleksleri saptandı. Ancak, bu analizler kapsamlı olmaktan çok uzaktı ve yeni meclislerin tarafsız bir şekilde tanımlanmasına izin vermedi. Kütle spektrometrelerinin ve etiketsiz niceliklendirme yöntemlerinin performansı o zamandan bu yana önemli ölçüde artmıştır ve bu da kapsamlı BN-MS analizlerine olanak sağlamıştır. Bu terim “complexome profilleme” icat etti. Örneğin, Heide ve iş arkadaşları sıçan kalp mitokondrisini tespit edip 464 mitokondriyal proteini kümeleyerek analiz ettiler ve bu da bilinen birçok derlemeyi doğruladı. Buna ek olarak, TMEM126B belirli bir montaj kompleksi3bir roman ve önemli bir alt birim olarak bulundu. Hek hücreli mitokondri4’ünparalel çalışmasında karşılaştırılabilir sonuçlar (437 mitokondriyal protein profili ile) elde edilebildi.

Bu gelişmelere rağmen, karmaşık profilleme için BN-MS tam potansiyelini dizginlemek çeşitli konular kalmıştır. Önemli bir sınırlama, iki faktörtarafından belirlenen komplekslerin etkili boyut çözünürlüğüdür: (i) jel matris degradesinin tekdüzeliğine ve örnek komplekslerinin stabilite/çözünürlüğüne bağlı olarak BN-PAGE ayrımının kalitesi, ve (ii) jel örnekleme adım boyutu, hangi en iyi 1 mm konvansiyonel manuel dilimleme kullanırken5,6. Zayıf boyut çözünürlüğü sadece ince karmaşık izoformları ve heterojenlikleri özlemekle kalmıyor, aynı zamanda tarafsız, de novo alt birim atama ve nicelemenin dinamik aralığını ve güvenini de olumsuz etkiler.

Diğer zorluklar arasında protein nicelemesi hassasiyeti ve kütle spektrometrik analizi ile numunedeki gerçek dinamik protein bolluk aralığının kapsamı yer almaktadır. Bu nedenle, BN-MS complexome profilleme uygulaması büyük ölçüde daha düşük karmaşıklık, hedef komplekslerin yüksek ekspresyonu ve uygun solubilizasyon özellikleri (yani, plastidler, mitokondri ve biyolojik örnekler ile sınırlı kalmıştır mikroorganizmalar)6,7,8,9,10.

Yakın zamanda, BN-PAGE jel şeritlerinin hassas milimetre altı örneklemesini kapsamlı MS analizi ve yüksek protein profillerinin belirlenmesi için ayrıntılı MS veri işlemeile birleştiren kriyomikrotom dilimleme destekli BN-MS ‘i (csBN-MS) tanıttık. güven11. Sıçan beyinlerinden mitokondriyal membran preparatına yapılan uygulama, daha önce karşılanmamış etkili karmaşık boyut çözünürlüğü ve oksidatif solunum zinciri kompleksi (OXPHOS) alt birimlerinin maksimum kapsama alanını (yani 90 MS’nin 90’ı erişilebilir) göstermiştir. Bu örnekte bir dizi yeni protein derlemesi de tanımlanmıştınız.

Burada açıklanan protein komplekslerinin preparatif ölçekli BN-PAGE ayırma (belirli bir biyolojik kaynak ile sınırlı değildir), büyük preparatif BN-PAGE jellerin döküm, geniş jel şeritler kriyomikrotom dilimleme ve MS verileri için optimize edilmiş prosedürler Işleme. Yüksek çözünürlüklü profiloluşturma performansı fare böbrek endozos zenginleştirilmiş membranlar bir protein kompleksi hazırlık için gösterilmiştir. Son olarak, kütle spektrometrik nicelik artan çözünürlük ve hassas yararları tartışılmıştır.

Protocol

1. Preparative BN-PAGE Jel hazırlama 10 °C’ye kadar etkili soğutma seti ile orta-büyük formatdikey jel elektroforez sistemi (>10 cm jel ayırma mesafesi; 14 cm x 11 cm, 1,5 mm boşluk) kullanın. Bir pompa tarafından tahrik edilen iki odalı bir karıştırma degrade mikser kullanarak doğrusal veya hiperbolik gözenek gradyan jel (1,5-3,0 mm boşluk) döküm (Malzeme ve Reaktifler Tablosubakınız). Sunulan örnekte (lineer gradyan jel %1-): Oluşan ön (karıştırma) odası için 13 mL çözeltisi hazırlayın: 13% akrilamid (30% stok çözeltisi, 37.5:1.0 akrilamid:bisacrylamide), 0.75 M aminocaproik asit, 50 mM Bis-Tris (pH = 7.0) ve 10% gliserol. Rezervuar odası için %1 akrilamid ( stok çözeltisinden, 37.5:1.0 akrilamid:bisacrylamide), 0.75 M aminocaproik asit, 50 mM Bis-Tris (pH = 7.0) ve %0.2 CL-47 deterjanından oluşan 10 mL’lik bir çözelti hazırlayın. Karıştırıcıyı çalıştırın ve ön odadaki çözeltiye 30 mikrolitre APS (amonyum peroksodisülfat, stok çözeltisi) ve 2,5°L TEMED (N,N,N’,N’-tetrametil etilenediamin) ve 2,5 mikrolitre TEMED ekleyin. Pompayı çalıştırın ve ön vanayı açın (akış 10 dakika içinde dökümü tamamlamak için ayarlanmalıdır). 1 dk sonra rezervuar odasındaki çözeltiye 90°L APS ve 5°L TEMED ekleyin ve oda bağlantısını açın. Jelin, homojen bir gözenek boyutu degradesi oluşturmak için oda sıcaklığında (RT) en az 24 saat boyunca yavaşça ama iyice polimerize olmasına izin verin. Nemli tutulduğunda polimerize jel 4 °C’de 1 haftaya kadar dik olarak saklanabilir.NOT: Kasıtlı olarak, jel üst yumuşak / sümüklü tutarlılık olacaktır. Bu daha sonra kaldırılacak ama jel içine proteinlerin düzgün girişini sağlar, aksi takdirde göç eserleryol açabilir protein yağış minimum risk ile (yani, çizgili veya protein yağış). Numune hazırlama ve yükleme 0,5-2,0 mg proteinayırmak için cam plakalar arasına uygun boşluklar (örneğin, silikon tüpler) yerleştirerek yükleme yuvalarını hazırlayın. Yuvalar en az 3 cm genişliğinde (veya daha iyisi, 5-6 cm genişliğinde) yapılmalıdır. Solubilize ~ 2.5 membran mg (fare böbrek endozos-zenginleştirilmiş hazırlık) 2 mL solubilizasyon tampon içeren 1% (w / v) non-denaturing deterjan (ComplexioLyte CL-47) buz üzerinde 30 dakika. Ultracentrifugate (sedimantasyon kesme = 200 S veya daha az; 130.000 x g/11 dk burada kullanılır). 400.000 x gaz 1 saat ultracentrifugation tarafından kısa bir% 50/20% (w / v, 0.3 ml her) sakaroz adım gradyanı konsantre solubilisat . Son protein verimi en az 1 mg olmalıdır. Solubilisata %0,05 (w/v) Coomassie G-250 ekleyin ve numuneyi jelüzerine yükleyin. Yüksek çözünürlük elde etmek ve protein çökeltmesinden kaynaklanan eserlerden kaçınmak için protein yükünü 10-15 μg/mm2 jel şeritkesiti ile sınırlandırın. BN-PAGE çalışma koşulları Çalışan tamponlar için, 50 mM trikin, 15 mM Bis-Tris ve %0,01 Coomassie G-250’den oluşan standart bir katot tamponu hazırlayın. 50 mM Bis-Tris (pH = 7.0) içeren standart bir anod arabelleği hazırlayın. 10 °C’de bir preparative BN-PAGE çalıştırın üç adımlı voltaj protokolü13 oluşan: 100 V 30 dakika için bir denge fazı, daha sonra maksimum voltaj (40-50 V/cm jel uzunluğu) için yavaş (3 saat) rampa nihayet için en az 6 saat korunur proteinlerin uç nokta odaklama.NOT: Göç cephesi jelin ortasına ulaştığında elektroforezin duraklatılması ve katot tamponunun Coomassie G250 olmadan taze tamponla değiştirilmesi önerilir. Bu matris gözenek yapısının yerel çöküşü nden kaynaklanan jel yağış eserler önlemek için yardımcı olur. 2. Jel örnekleme ve sindirim Jel şeritlerinin eksizyonu Çalışmadan sonra, cam plakalar arasında tutarken dokümantasyon amaçlı jelleri tarar. Plakaları sökün ve şerit bölümünü(ler) çıkarın. İlgi bölgelerini, etkili karmaşık boyut çözünürlüğünü ve protein bolluğunu belirlemek için 2D BN/SDS-PAGE ve protein boyama veya batı lekeleme (Şekil 1B’degösterildiği gibi) analiz için şeritten örnek bir şerit alın. Seçilen jel şeritlerini en az 30 dakika boyunca (v/v) etanol ve (v/v) asetik asit ile iki kez düzeltin. Numuneyi gömme ortamına aktarın ve jel levhayı yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde yavaş çekimde tutarken 4 °C’de en az 2 saat bekletin ve dengeleyin.NOT: Jel ayırma, genel ayırma kalitesi ve geçiş yapıları için dikkatle kontrol edilmelidir. Baskın proteinleri temsil eden jel bantları distorsiyonsuz ve homojen yoğunlukta olmalıdır. Jel üzerindeki yerel eserler excised veya analiz dışında bırakılmalıdır. Katıştırma ve kriyomikrotom dilimlemeNOT: Bu, daha önce 8 cm11’ekadar daha geniş jel şeritlerinin katıştırılması ve dilimlemesine olanak tanıyan, açıklanan ve fotoğrafla belgelenen katıştırma prosedürünün geliştirilmiş bir sürümüdür. İlk olarak, sabit jel şeritli keserek keserek (burada, 3 cm) protein göç ön /bant desenine tam olarak paralel. Daha kolay kullanım için, her bölümü eşit boyutlarda plastik film desteğine yerleştirin. Şeritleri stoperlerle açık bir tüpe aktarın (alt kısımda kapalı, üst kısmında merkezi delikli, jel bölümünün üst ve alt uçlarıyla tam olarak hizalanmış). Katılaşmayı hızla başlatmak için silindiri sıvı nitrojene kısa bir süre batırın. Saydam gömme ortamı saniyeler içinde katılaşır ve beyaz renkli olur. Boşluğu gömme ortamıyla doldurun, kısa bir süre sıvı nitrojene batırın ve silindiri -20 °C’de birkaç saat dondurun.NOT: Silindirin sıvı nitrojene batırarak hızla soğutulması, tüpün içindeki jel levhasının yer değiştirmesini önlemeye yardımcı olur. Aşağıdaki MS analizinde yüksek çözünürlük sağlamak için bozulmadan kaçınılmalıdır. Söküldükten sonra, plastik filmi çıkarın ve gömülü jel bölümü ile bloğu soğutulmuş, çapı daha büyük, düz bir destek üzerine yerleştirilen metal silindire (yani Petri kabına) aktarın ve silindirin dış kısmına gömme ortamı ile kapatılır. Katıştırma ortamı ile silindirdoldurun ve iyice dondurun. Koplanar yüzeylere sahip katı bir blok elde etmek için silindirin diğer tarafıyla bu işlemi tekrarlayın. Silindirden bloğu çıkarın, önceden soğutulmuş bir metal tutucuya katıştırma ortamı yla yapıştırın ve tutucuyu kriyoslikasyon makinesine (kriyotom) yerleştirin. Bloğun yüzeyi dilimleme düzlemine göre dikkatlice hizalanmalıdır. Dilimleme işlemi için optimum sıcaklıkta dengelemesine izin verin (burada, -15 °C).NOT: Doğru konumlandırmayı sağlamak için gömülü jel bölümünün yüzeyine vurana kadar 0,1 mm adım boyutunda yavaş ilerleyen manuel dilimleme döngüsü kullanın. 0,25 mm adım boyutunda son istenilen kalınlıkta jel dilimlerini birbiri ardına hasat edin ve düşük protein bağlayıcı özelliklere sahip reaksiyon tüplerine tek tek aktarın.NOT: Bu kurulumda, tek tip jel dilimleri 0,1 mm kadar ince ve 0,5 mm kalınlığında kolayca elde edilebilir. Triptik sindirim Jel dilimleri geniş yıkama sonra jel triptik sindirim gerçekleştirin (yıkama en az üç ek tur gömme ortamının polimerik bileşenleri kaldırmak için tavsiye edilir) standart bir prosedür11aşağıdaki . Vakum-kuru eluted peptidler ve 37 ° C (10 dakika) de sallayarak% 0.5 (v / v) trifloroasetik asit içinde yeniden çözünür ve banyo sonication (5 dk) ve kısa santrifüj izledi. 3. Kütle spektrometresi nanoHPLC ve MS kurulumu Sindirilmiş numuneleri %0,05 (v/v) trifloroasetik asit le c18 ön sütununa (parçacık boyutu = 5 μm; çap = 300 μm) yükleyin ve yüksek çözünürlüğe sahip bir kütle spektrometresi ile birleştiğinde (split-free) nano-HPLC alın. Elute ele geçirilen peptidler sulu-organik degrade (eluent A): 5 dk %3 B, %3 B’den B’ye 120 dk, B’den B’ye 20 dk, B’den 5 dk B’ye 5 dk, B %3’e, 15 dk %3 B (akış hızı = 300 nL/dk) ele geçirdi.NOT: csBN-MS jel dilimleri genellikle düşük ve orta peptid bolluğu ve sınırlı derecede karmaşıklığa sahip örneklerle sonuçlanır. nanoLC-MS/MS analizi bu nedenle makul hassasiyet ve sıralama hızı, yüksek kütle çözünürlüğü (>100.000) ve maksimum dinamik aralık (etkili 3-4 kadir sırası) sağlayan bir kurulum ile yapılmalıdır. Ancak, uzun sütun boyutları veya 3 saat ötesine uzatılmış elüsyon degradeleri gerektirmez. Bir yayıcıda ayrı eluted peptidler (yani 75 μm; uç = 8 μm) manuel C18 malzeme (parçacık boyutu = 3 μm) ile yaklaşık 20 cm paketlenmiş. Numuneleri 2,3 kV (pozitif iyon modu) halinde kütle spektrometresinin ısıtılmış transfer kılcal damarına (250 °C) elektrosprey yapın. Aşağıdaki cihaz ayarları11:maksimum MS/MS enjeksiyon süresi = 400 ms ile analizler yapın; dışlama süresi = 60 s; minimum sinyal eşiği = 5.000 sayar, en iyi 10 öncülparçalanmış; izolasyon genişliği = 1,0 m/z).NOT: Çok sayıda veri kümesi veya ölçümde kütle, bekletme süresi ve peptid sinyallerinin ayarlanması kolaylaştırmak için, ilgili MS ölçüm serilerinin herhangi bir kesinti veya parametrelerde ve donanımda değişiklik olmadan gerçekleşdirilmeniz önerilir ( yani, aynı C18 sütununda/yayımlayıcısında). Protein tanımlama (MS verileri daha önce açıklandığı gibi değerlendirildi11) “msconvert.exe” aracını (ProteoWizard’ın bir parçası) kullanarak parça iyon spektrumlarından tepe listelerini ayıklayın. 50 ppm peptit kütle toleransı ile bir ön veritabanı aramasında proteinlere atanan tüm peptitlerin medyan m/z ofset’i ile her veri kümesi için tüm öncül m/z değerlerini kaydırın. UniProtKB/Swiss-Prot veritabanının tüm fare girişlerine karşı uygun bir arama motoruyla (burada Maskot 2.6.2) düzeltilmiş tepe listelerini arayın (sürüm 2018_11). “Asetil (Protein N-terimi)”, “Karbamidometil (C)”, “Gln | pyro-Glu (N-dönem Q), Glu | pyro-Glu (N-terimi E)”, “Oksidasyon (M)”, ve “Propionamide (C)” değişken modifikasyonlar olarak. Peptit ve parça kütle toleransı ± 5 ppm ve ± 0.8 Da’ya ayarlayın ve bir tanesinin cevapsız triptik dekoltesine izin verin. Peptit tanımlaması için beklenen değer kesimini 0,5 veya daha az olarak ayarlayın. Yanlış pozitif bulma oranını (FDR) belirlemek için bir yem veritabanı araması kullanın. FDR’yi %1 olarak ayarlayın veya güvenilir tanımlama sağlamak için ek kalite kriterleri uygulayın.NOT: Sunulan deneyde 3.500’den fazla protein saptandı ve ortalama peptit FDR %4.4 ± 0.77 (n = 101 dilim örnekleri) veya peptid FDR%1’e ayarlandığında 3,000 protein saptandı. Daha da önemlisi profilli proteinlerin seçiminde daha sıkı kriterler kullanılmıştır (2.568). 101 dilim örneğinden en az birinde en az biri proteine özgü olmak üzere en az iki peptidle tanımlanan tüm proteinler ilerlerdi. Protein nicelemi FT tam taramaları elde edilen ve uygun yazılım (burada, MaxQuant v1.6.3) kullanarak bekletme süresi ve kütle vardiyaiçin doğru protein niceliği için peptit sinyal yoğunlukları (pik hacimleri [PVs]) kullanın. LOESS regresyon unu kullanarak MS veri kümelerini referans (toplam ortalama) peptid elüsyon sürelerine tek tek hizalayın. PVs’yi peptidlere doğrudan (MS/MS tabanlı tanımlama) veya dolaylı olarak (yani, çok dar toleranslar içinde eşleşen m/z ve elüsiyon sürelerine bağlı olarak) atayın.NOT: Bu protokol, “eklenen” peptidler atama için şirket içi yazılım kullanır. Parametreleri ayarlamak, sırasıyla ± 2 ppm ve ± 1 dk’lık etkili m/z ve elüsyon süresi eşleştirme toleransları ile sonuçlanır (bkz. Şekil 2A,B). Komşu dilim örnekleri arasındaki göreceli peptit yoğunluklarının ortanca farklılıklarından hesaplanan peptit yoğunluğu rescaling ile peptit yükü ve iyonizasyon verimliliğindeki sistematik koşu-çalıştır varyasyonları için doğrudur(Şekil 2C). Dışlayıcılar ve iç PV tutarlılık çözümlemesi ile tanımlanan kalan yanlış pozitif atamalar için PV verilerini filtreleyin. Göreceli peptit bolluğu profilleri veren tüm dilim veri kümeleri üzerinde her peptidin pVs maksimum değerlerine normalleştirin. Son olarak, en az iki (ve en fazla altı veya% 50, hangi değer daha büyüktür) üç ardışık dilim bir pencere üzerinde en iyi korelasyon peptid profilleri ortalamaları olarak göreli protein bolluk profilleri hesaplamak. Bu, eksik PV değerlerinin köprülemesine ve gürültünün azaltılmasına olanak tanır.NOT: Sonuç olarak 2.545 (önceden seçilmiş 2.568) protein profili(Şekil 2D). Protein komplekslerinin karakterizasyonu Yerel maxima yöntemini kullanarak ilk olarak pik algılama gerçekleştirerek protein profillerini analiz edin ve bu zirvelere ardışık olarak normal dağılımlar sığdırarak maxima ve FWHM ‘lerinin (tam genişlikte) konumunu (yani dilim indeksi veya görünür karmaşık boyutu) verir yarım maksimal yoğunluk) değerleri (Şekil 4’üninset’i).NOT: Veri kümesinde profiller özel komut dosyaları kullanılarak otomatik olarak analiz edilir. En küçük FWHM değerleri yaklaşımın etkili boyut çözünürlüğünün göstergesidir (burada 6 x 0,25 = 1,5 mm). Dilim sayı endekslerini görünür moleküler boyutlara dönüştürmek için log10(tahmin edilen moleküler kütle) değerlerinin doğrusal regresyon analizi için tanımlı moleküler kütleye sahip (UniProtKB/Swiss-Prot veritabanında bildirildiği gibi) referans protein kompleksi zirveleri kullanın (örn. kDa belirgin karmaşık boyutu).NOT: Bu çalışmada(şekil 4)profil zirvelerinin monodisperse şekilleri, (ii) moleküler ağırlıkların deneysel desteği ve (iii) araştırılan BN-PAGE jel bölümleri boyunca dağılımları esas alınarak örnekteki 23 marker kompleksi seçilmiştir.

Representative Results

Konvansiyonel BN-MS çalışmalarının büyük çoğunluğu ve yakın zamanda kurulan yüksek çözünürlüklü csBN-MS yaklaşımı (i) hazır olan mitokondriyal ve plastid preparatlarına uygulanmıştır, (ii) sınırlı karmaşıklığa sahiptir ve (iii) yüksek yoğunlukta hedef (membran) protein kompleksleri. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü complexome profilleme uygulamasını düşük bol proteinleri ifade eden mitokondriyal olmayan membranlara genişletir ve komplekslere entegrasyonu hakkında çok az bilgi mevcuttur. Gösteri amacıyla, yoğunluk gradyan santrifüj ile elde edilen fare böbreği bir endozom zenginleştirilmiş membran preparat seçti. Bu preparatın optimizasyonu, hücre içi iyon kanallarını oluşturan marker protein TPC1 tarafındanyönlendirilmiştir. Böbrek dokusu kesitlerinin immünohistokimyasal analiziile gösterildiği gibi renal proksimal tübüler hücrelerde de yüksek oranda ifade edilir (Şekil 1A). Bu membranlar hafifçe çözünür (ComplexioLyte 47 düşük protein: deterjan oranı 1:8) ve ultrasantrifüj ile bir sakaroz yastık üzerinde yoğunlaşmıştır. İkincisi, preparatif BN-PAGE ayrımlarının çözümünü olumsuz etkileyen aşırı düşük molekül ağırlıklı bileşenlerin (yani deterjanlar, lipidler, tuzlar, organik polimerler ve metabolitler) ortadan kaldırılması için önemli bir adım olduğu ortaya çıktı. Yerli %1-13 (w/v) poliakrilamid gradyan jel(Şekil 1B, orta panel) üzerinde kompleks ayırma çok az göç objesi olan güçlü lekeli protein bantları gösterdi. SDS-PAGE dar bir BN-PAGE jel şeridinin ayrılması(Şekil 1B, çerçeve kırmızı kutulu) ikinci bir boyut olarak batı leke analizi nin ardından farklı TPC1 ilişkili karmaşık popülasyonların iyi çözülmüş bir deseni göstermiştir (Şekil 1B , üst panel, kırmızı oklarla işaretlenmiş), büyük olasılıkla ek protein alt birimleri ve/veya çeviri sonrası modifikasyonlarla ilişkilendirilmesinden kaynaklanan (glikozilasyongibi 12). 3 cm’lik bir ilgi bölümü excised, sabit ve kriyomikrotom dilimleme için işlenmiş olarak tarif11. Örnekleme sırasında çözünürlüğü korumak için kritik öneme sahip olan bu yordamın tek tek adımları (özellikle geniş jel bölümünün kesin hizalaması) eşlik eden videoda belgelenmiştir. Gömülü jel bölümü sonunda 0.25 mm(Şekil 1B, alt panel) tek tip kalınlığı ile 101 jel dilimleri halinde kesildi, hangi ayrı ayrı sindirilir ve yüksek performanslı LC-birleştiği kütle spektrometresi tarafından analiz edildi. Boyut çözünürlüğüne ek olarak, protein nicelemesi kalitesi başarılı complexome profilleme için anahtardır. MS kurulumu ve kullanılan ayarlarla, numunelerin analizi oldukça kapsamlıydı ve bu da dilim başına 1.000’den fazla protein ve 10.000 peptidin (8.200’ü proteine özgü) ve yaklaşık 3.000 protein ve 43.000’in tanımlanmasıyla sonuçlandı. peptidler (38.500’ü proteine özgüidi) toplam. Bununla birlikte, veriye bağımlı MS/MS diziliminin stokatik yapısı ve dinamik aralıktaki sınırlamaları nedeniyle, yoğunluk bilgisi daha az bol protein ler için hala parçalıydı. Bu nedenle, tüm veri kümeleri serisi boyunca peptit sinyallerinin (tepe hacimleri [PVs] = m/z ve zaman ayarı boyunca entegre edilmiş peptidle ilgili sinyal yoğunluklarının) kesin olarak atanmasına dayanan ayrıntılı bir MS veri işleme prosedürü11gerçekleştirilmiştir. Şekil 2A,B’degösterildiği gibi, kalibrasyondan sonra kalan kütle ve bekletme süresindeki peptit sinyallerinin sapmaları MS sıralı ve dolaylı olarak atanan PV’ler için aynıydı (çok dar toleranslarla <1 ppm ve <0,5 dk % 95 PVs), yanlış pozitif PV atama için çok düşük bir oranı göstergesidir. Kalan aykırılar, diğer ilgili PV'lerle tutarlılıklarına göre filtrelendi. Tüm MS ölçümleri, parametrelerde veya donanım bileşenlerinde değişiklik olmadan aynı LC-MS kurulumunda ardışık olarak gerçekleştirildiğinden, çalıştırılabilen varyasyonlar (komşu dilimlere göre bir örnekteki tüm PV yoğunluklarının ortancası olarak belirlenir) küçük ve kolayca PV veri kümelerinin rescaling tarafından ortadan kaldırıldı (Şekil 2C). Elde edilen peptit yoğunluğu bilgileri daha sonra 2.545 protein bağıl bolluk profilini yeniden oluşturmak için kullanıldı. Şekil 2D’degösterildiği gibi, bu protein profillerinin ‘ten fazlası en az üç bağımsız proteine özgü peptide dayanıyordu. Daha sonra protokol, protein komplekslerinin çözümü için BN-PAGE jel örneklemesinin adım boyutunun önemini değerlendirdi. Bu amaçla, dilim veri kümeleri, pv bilgilerinin iki, üç veya dört ardışık dilimden toplamı yla birleştirilmiş ve böylece 0,5 mm, 0,75 mm ve 1 mm’lik adım boyutlarıiçin sonucu simüle edilmiştir (0,25 mm’lik orijinal örneklemeile karşılaştırıldığında). Şekil 3 protein TPC1 için ortaya çıkan bolluk profillerini örnek olarak göstermektedir (A-D). 0.25 mm’de, TPC1 ile ilişkili karmaşık popülasyonların göreceli yoğunlukları ve boyut ayrımı(Şekil 3A)batı leke analizi(Şekil 1B, üst panel) sonuçlarıyla iyi bir uyum içinde idi; ancak, profil, çoğunlukla sayısallaştırma için kullanılan PV matrisindeki eksik değerlerden (“boşluklar”) kaynaklanan bazı gürültüler göstermiştir. 0,5 mm’ye karşılık gelen iki dilimin birleştirilmesi, TPC1 ile ilişkili komplekslerin doğru yoğunluklarını ve ayrıştırmalarını korudu ve niceliksel gürültüyü kaldırdı (Şekil 3B). Buna karşılık, 0,75 mm ve 1 mm ‘lik daha büyük adım boyutları(Şekil 3C,D)boyut çözünürlüğü kaybına ve TPC1 kompleks alt popülasyonlarının ayrımcılığının kaldırılmasına yol açmıştır. Bu yayınlanan geleneksel BN-MS analizleri büyük çoğunluğu manuel olarak 2 mm dilim (yaklaşık 60 tüm jel şerit kapsayacak şekilde kesilmiş)7,8,9,10kullanmak unutulmamalıdır. Göç mesafesinin veya dilim indeksinin moleküler boyuta dönüştürülmesi genellikle belirteçlere, ticari olarak mevcut yerel standart proteinlere veya bilinen alt birim bileşimine sahip iyi karakterize endojen protein komplekslerine dayanır (çoğunlukla [süper] mitokondriyal oksidatif solunum zinciri kompleksleri [OXPHOS])13. Ancak, BN-PAGE ayrımı sadece moleküler kütle tarafından değil, aynı zamanda ilişkili lipidler, deterjan ve Coomassie moleküllerinin 3Boyutlu yapısı ve sayısı ile belirlenen etkili moleküler kesite dayandığından, bireysel proteinler daha büyük sapmalar. Bu nedenle, belirteçleri11olarak protein kompleksleri daha büyük setleri kullanmak için seçildi. Şekil 4’teki çizimde, siyah daire olarak gösterilen temsili bir alt birimile seçilen 23 işaretleyici, öngörülen moleküler kütlesinin log10 değerlerini (UniProtKB/Swiss-Prot veritabanına göre) ve. ilgili profil tepe maksimum dilim dizini. Sonuncusu, şekil 4’ün insetinde gösterildiği gibi, resperon BCS1 ile örnek gösterilen, otomatize Gaussian uygun göreceli bolluk verileri elde edilmiştir. Lineer regresyon (kırmızı çizgi), dilim indeks değerlerini, incelenen jel bölümü boyunca 160-630 kDa arasında değişen görünür moleküler boyutlara dönüştürmek için bir işlev sağlamıştır. Son olarak, analiz iyi karakterize kompleksleri hakkında bilgi verdi ve yeni alt birimler ve karmaşık derlemeler varlığını gösterdi. Complexomun farklı yönlerini vurgulayan örnekler Şekil 5’te gösterilmiştir (A-C: endozomal bölmelerde ifade edilen veya tercihen bulunan proteinler; D-F: diğer hücre altı yerelleştirmelerden kompleksler). Demir taşıyan protein ferritinin 24 hafif (FRIL1) ve/veya ağır (FRIH) alt birimlerinden oluşan kompleksler oluşturduğu ve toplam molekül ağırlığı 440 kDa14 (Şekil 5A, doldurulmuş ok) olduğu bilinmektedir. Alt birim profilleri(Şekil 5A),kompleksin en az iki küçük formunun (görünür kütlesi 360 kDa ve 340 kDa; açık oklar) ve belirgin ağır/hafif zincir stokiyometries (yeniden ölçeklendirilmesinden sonra daha iyi görülebilir) bolluk, Şekil 5A’nın inset) endozozoslarda bolca bulunan. Buna karşılık, nicalin-nomo1 kompleksleri15 (Şekil 5D), gama-sekresalgılanan çekirdek kompleksi16 (Şekil 5B), ve GPI-transamidaz makineleri17 (Şekil 5E) sabit tüm boyut aralığında çekirdek alt birimlerinin bolluk oranları ve ek proteinler ile ilişki bağımsız. Bu, alt birimlerinin birbirine özel olduğunu gösterir. Vacuolar H+-ATP’ler, toplam molekül ağırlığı yaklaşık 900 kDa olan modüler bir şekilde 20’den fazla alt birimden oluşan bir havuzdan monte edilen multiprotein kompleksleridir. Şekil 5C, biyolojik (dis)montaj aralarını veya deneysel koşullar tarafından üretilen alt kompleksleri temsil eden en az 17 alt birimden farklı bileşimlere sahip alt kompleksleri ortaya çıkarır ve bunların bir kısmı da yakın zamanda yapılan bir BN-MS çalışmasında gözlenen18. Bir diğer çoklu protein kompleksi örneği proteozom19 ‘dur (Şekil 5F). 20S proteozom çekirdeğini oluşturan alfa ve beta alt birimlerinin bolluk profillerinin yakından incelenmesi, ince boyut farklılıkları (gri oklarla gösterilen 590 kDa ve 575 kDa) ve üç beta alt biriminin entegrasyonuna sahip iki büyük karmaşık popülasyonu göstermektedir. Özetle, endozomla zenginleştirilmiş böbrek zarlarının csBN-MS complexom profillemesi , (i) tektip, düşük bol hedef proteinlerin komplekslere entegrasyonu, (ii) genel kompleks alt birim bileşimi ve stokiyometri ve (iii) karmaşık heterojenlikler, alt yapılar ve (dis)montaj ara ları. Şekil 1: Hücre içi kanal TPC1’i bir belirteç olarak kullanarak fare böbreğinden solubilize endozomla zenginleştirilmiş membranların preparatif BN-PAGE ayrılması. (A) Renal proksimal tübüllerde TPC1 proteininin konfokal mikroskopi ile immünhistokimyasal lokalizasyonu. Yeşil: anti-TPC1 antikor12 ikincil Cy3-biyotinylated keçi anti-tavşan IgG ile görselleştirilmiş boyama; kırmızı: biyotinylated Lotus tetragonolobus lektin (LTL, 10 μg/mL, FITC konjuge) proksimal tubulus hücrelerinin luminal yüzeyini işaretleme. Inset negatif kontrol olarak bir TPC1-KO böbrek karşılık gelen bir bölüm boyama gösterir. Beyaz pul çubukları 20 μm’dir. Ayrıca dikkat hücre içi veziküllerde güçlü TPC1 ifadesidir, bağımsız deneylerden bilinen erken ve geri dönüşüm endozomları temsil etmekiçin 12. (B) Preparative BN-PAGE ayırma 2.5 solubilize endozom ile zenginleştirilmiş membranlar bir% 1-13 (w / v) poliakrilamid gradyan jel üzerinde mg. Sonraki SDS-PAGE/western leke analizi (üst panel) için dar bir şerit kesildi, farklı TPC1 ilişkili kompleksleri ve glikozilasyon desenleri (kırmızı oklar: anti-TPC1/anti-tavşan HRP/ECL asal; yeşil: pozisyonlar ve tahmin blotun toplam protein boyama [SYPRO Ruby leke]) ile tanımlanan marker protein komplekslerinin kitleleri [MDa]. Sağdan sola: Na+/K+-taşıma ATPase, Sitokrom b-c1 kompleks dimer, ATP synthase, NADH:ubiquinone oxidoreductaz. Jel şeridinden 3 cm’lik bir ilgi kesiti çıkarıldı, doku gömme ortamına gömülmüş, monte edilmiş ve protein göç cephesi boyunca 101 kesite (0,25 mm) dilimlenmiş bir kriyomikrotom (alt panel; bkz. video bağlantısı). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: MS sinyal atamave nicelemenin doğruluğunu ve analiz derinliğini belirleyen temel parametreler. (A) MS/MS sıralı (kırmızı çubuklar) ve dolaylı olarak atanan (yani, yakından eşleşen kütle ve bekletme sürelerine bağlı olarak, protokole bakınız; mavi çubuklar) peptid sinyallerinin m/z kalibrasyonundan sonra göreli kütle hatalarının (ppm’de) dağılımı. Bu, <1 ppm (sinyallerin 'i/atanan PV'ler için) ve çok düşük bir yanlış pozitif atama oranının son toplu hatasını önerir. ( B ) (A)'da kullanılan Loess regresyonu(protokolebakınız) ve renk kodlaması kullanarak peptit sinyallerinin elüsiyon süresi hizalanmasından sonra nano-HPLC tutma süresi sapmalarının toplam ortalamadan dağılımı. Zaman hatası, peptid sinyallerinin /atanan PV’lerin ‘i için 30’dan azdır. (C) İki komşu numunenin ortalamasına göre çizilen toplam MS yoğunluklarının çalıştırılan değişimi. Bu ölçek faktörleri, sistematik teknik hataları en aza indirmek için ham PV tablolarına uygulanmıştır. (D) Proteinlerin göreceli bolluk profillerinin hesaplanmasında kullanılan peptit bilgileri. Dış layıcılar için proteine özgü peptidler, düşük puanlı veya tek tanımlamalar (protokole bakınız) filtrelendikten sonra, 2.545 protein bolluğu profili belirlendi ve bunların ‘i makul güvene sahip en az üç peptide dayanıyordu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Jel örneklemede adım boyutunun TPC1’in complexome çözünürlüğü üzerindeki kritik etkisi. Veri kümeleri, 1, 2, 3 ve 4 ardışık dilim (sırasıyla A-D) gruplar halinde sinyal yoğunlukları toplamı ile birleştirilmiş ve jel dilimleme de farklı adım boyutları simüle etmek için aynı şekilde işlenmiştir. TPC1 profili, 0,25 mm’de bazı (aşırı örnekleme) gürültü gösterir, ancak büyük ölçüde 0,5 mm adım genişliğinde korunan üç karmaşık popülasyonun (ayrıca Şekil 1B’yebakınız) iyi boyut çözünürlüğü gösterir. 1 mm yaklaştıkça bu popülasyonların ayrımcılığı kaybolur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Görünür molekül ağırlığının belirlenmesi. Tanımlı moleküler bileşimli 23 marker kompleksi (uniProtKB/Swiss-Prot’a göre belirtildiği gibi) boyut belirteçleri olarak kullanılmıştır. Beklenen molekül ağırlıklarının logaritmik değerleri (kDa’da) vs.çizilmiştir. belirtilen temsili protein alt biriminin (siyah dolgulu daireler) profil tepe maksimum dilim indeksi. Bu verilere (kırmızı çizgi) uygun doğrusal regresyon, dilim indeksi değerlerini görünen molekül ağırlıklarına dönüştüren bir işlev sağladı. Peak maxima, refakatçi proteini BCS1’in (mavi deki birincil veri, turuncu çizgilerle gösterilen uygun sınırlar, kırmızıya sığdır) insetinde (sağda) gösterildiği gibi protein profili zirvelerine otomatize gaussian uygunluğu ile belirlendi. Buna ek olarak, bu uyumlar, 1,5 mm’lik bir jel etrafında yayılan en keskin odaklama kompleksleri ile en yüksek yarım maksimal genişlikleri (yeşil çizgi, 6,5 dilim veya gösterilen örnek için 1,6 mm) olarak belirlemiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Protein kompleksi alt birim profillerine örnekler. Bağıl protein bolluğu vs. ağır ve hafif ferritin zinciri için çizilen belirgin molekül ağırlığı(A) ferritin alt birim stoiyometrinin moleküler heterojenliğini ortaya çıkarır, bollukların yeniden ölçeklendirilmesinden sonra daha net görünür (inset). Dolu ok ve açık oklar, sırasıyla tam kompleksi (440 kDa) ve iki alt kompleksi gösterir. Gama salgısı (B) alt birimleri nicel olarak tek çekirdekli karmaşık popülasyona entegre edilmiştir. Vakuolar H+-ATPazların(C)alt kompleksleri, hepsi endozomlarda ifade edilen farklı alt birim kompozisyonuna sahip birden fazla derleme sergiledi. Nomo1 ve nicalin proteinleri(D),çeşitli kompleksleri oluşturan çok-alt birim enzimatik bir makine olan özel bir kompleks (GPI-transamidaz) oluşturmuştur. (E) 20S proteozal çekirdek kompleksi gösteren (F) gri oklar ile gösterilir iki popülasyon ile ince bir alt kompleks desen, tüm diğer hücrealtı yerelleştirmeler kaynaklanan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

CSBN-MS tekniği üzerine inşa edilen sunulan çalışma daha önce mitokondriyal hazırlık11 ile kıyaslanmış ve numune hazırlama, jel işleme ve MS veri değerlendirmesinde iyileştirmeler içeriyordu. Büyük ölçekli ayırma BN-PAGE jel bir bölümünün odaklanmış analizi mitokondriyal membranlar ile çalışma ile karşılaştırılabilir kalite ölçüleri gösteren kapsamlı bir veri seti sağladı. Kütle ve bekletme süresi hatalarının yanı sıra run-to-run varyasyonları çok düşük tutuldu ve güvenilir protein bolluğu profillerinin belirlenmesi için temel oluşturdu. Boyut çözünürlüğü, altı dilim (1,5 mm, Şekil 4’ekarşılık gelen) gibi düşük yarım maksimal tepe genişlikleri ve %10’dan daha az çözünmüş göreli boyut farklılıkları ile iyi görünüyordu (Şekil 3, Şekil 5A). Bu değerler mitokondri önceki csBN-MS analizinin boyut çözünürlük kalitesini tam olarak karşılamadı (seçilen küçük jel örnekleme adım boyutuna rağmen), ancak geleneksel BN-MS veya boyut dışlama MS performansından önemli ölçüde daha iyidir son zamanlarda popüler hale gelmiştir20 yaklaşımlar.

Şekil 3’teki (TPC1 ilişkili kompleksler kullanılarak) 2D BN/SDS-PAGE batı leke analizi ile çözülebilen simülasyon deneyi(Şekil 1B)ile yüksek etkili karmaşık boyut çözünürlüğünün önemi vurgulanır. Bu sonuçlar, bu durumda 0,25 mm dilimleme bazı aşırı örnekleme sonuçlandı öneririz, ama bu hala etkili boyut çözünürlüğü ödün vermeden “niceleme gürültü” ortadan kaldırılması için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, önceki sonuçlar11doğrultusunda , ~0,3 mm bir örnekleme adım boyutu genellikle tavsiye edilir.

Özellikle, TPC1 ilişkili komplekslerin ayrımcılık tamamen 1 mm jel örnekleme ile kaybolur, hangi geleneksel BN-MS manuel dilimleme tarafından sağlanan en küçük adımboyutudur 5,6. Bu, güçlü MS teknolojilerinin mevcut olmasına rağmen, çok az protein kompleksi ve alt birimlerinin complexome profilleme ile de novo olarak tanımlandığı gerçeğini açıklayabilir. CSBN-MS, iyi çözme gücünün yanı sıra yüksek çok yönlülük sunar. Membrana bağlı kompleksler ve 50 kDa’dan birkaç MDa’ya kadar çözünebilir protein kompleksleri, tek bir deneyde minimum önyargı11ile etkin bir şekilde çözülebilir. Bu, belirli boyut aralıklarına veya şarj özelliklerine sahip çözünür proteinlerin alt kümeleriyle çalışan boyut dışlama veya iyon değişimi kromatografisi gibi kompleksom profilleme için kullanılan alternatif ayırma teknikleri ile tezat oluşturur. Dezavantajı, csBN-MS daha az ölçeklenebilir (jel başına ~ 3 mg protein maksimum yük), teknik olarak zor olabilir, ve otomatize edilemez.

Genel olarak, sonuçlar csBN-MS tabanlı complexom profillemenin mitokondriyal olmayan hedeflere başarılı bir şekilde uygulanabileceğini göstermekle birlikte, ilişkili bazı zorlukları da göstermektedir. Böylece, protein komplekslerinin verimli ekstraksiyonve biyokimyasal stabilitesi daha fazla optimizasyon gerektirir ve temizlik adımları ve hala sınırlı olabilir. İncelenmiş boyut penceresi içinde, iyi odaklanmış, monodisperse protein komplekslerinin sayısı mitokondriyal bir örneğe göre gerçekten çok daha düşüktü (veriler gösterilmedi). Ayrıca kabul edilebilir jel ayrımı elde etmek için BN-PAGE örnek yükleri düşürmek için tavsiye edilir. Daha yüksek yükler dilimleme için düzgün işlenmesi daha zor olan daha geniş jel şeritlergerektir (eşlik eden videoya bakın). Ayrıca, örneklerin protein karmaşıklığı mitokondri kaynaklı dilim sindirimdaha yüksek (yaklaşık iki kat) oldu, daha fazla eksik PV değerleri ve azaltılmış dinamik aralık yol. Aslında, Şekil 5’te gösterilen komplekslerin bir parçası olması beklenen bazı küçük proteinler analizlerde eksikti. Bu sorunlar gelecekte daha hızlı ve daha hassas MS araçları veya veri bağımsız edinme modları kullanılarak çözülebilir.

Numune hazırlama protein kompleksi alma, stabilite ve jel ayırma kalitesi için son derece önemlidir. Parametreler ve prosedürler her kaynak doku, hücre lisat, membran (fraksiyon) ve protein kompleksi ilgi için optimize edilmelidir. CSBN-MS uygulamalarının genişletilmesine yardımcı olabilecek aşağıdaki genel öneriler sağlanmıştır:

(i) Numunelerin taze hazırlanması ve ısınma/donma, güçlü seyreltmeler, tampon koşullarındaki değişiklikler ve gereksiz gecikmelerden kaçınılması;

(ii) Nötr bir pH hakkında tuzlardan yoksun (500-750 mM betain veya aminocaproik asit ile değiştirin), ve membranın çözünmesi için 1:4-1:10 arasında deterjan oranının %1’ine (w/v) kadar ını içeren tamponlar kullanmak protein kompleksleri, çözünür protein kompleksleri için hiçbir deterjan gerekli);

(iii) Deterjan koşullarının analitik BN-PAGE ile dikkatli bir şekilde test edilmesi ve ayarlanması, kompleks çözünürasyonun verimliliğini, membran protein komplekslerinin numunede temsilini, stabilitesini ve homojenliğini güçlü bir şekilde etkileyebiliyor. protein-deterjan micelles. İkincisi, proteinlerin BN-PAGE jelleri üzerinde farklı bantlar/karmaşık popülasyonlar olarak odaklanmaları için ön koşullardır. Önceki literatürde çok çeşitli nötr deterjanlar sunulmaktadır. Ancak, DDM (n-dodecyl β-d-maltoside)1,2,4,5,6 ve digitonin3,5,7,8, 9,10,13,18 şimdiye kadar BN-MS analizleri için en popüler seçimler olmuştur. Herhangi bir deterjan durumunun mutlaka çözünürleştirme verimliliği ile protein etkileşimlerinin korunması arasında bir uzlaşma yı temsil ettiği ve her türlü hedef protein ve kaynak materyal için eşit derecede uygun olmayabileceği vurgulanmalıdır;

(iv) Fibriller, filamentler, polilizin, DNA ve bol düşük molekül ağırlıklı bileşenler (örn. metabolitler, lipidler veya peptidler) gibi yüklü polimerlerin çıkarılması. Bu ultracentrifugation, jel filtrasyon veya diyaliz ile gerçekleştirilebilir. Bu özellikle toplam hücre veya doku lysates için önemlidir;

(v) Coomassie G-250 ekleme (son konsantrasyon %0.05-0.1%) ve sakaroz (yükleme için yoğunluğu artırmak için, son konsantrasyon 10%-20% [w/v]) yükleme hemen önce numuneye, kısa ultracentrifugation ile temizlemek için, pertürbasyon olmadan örnek yük ve hemen sonra koşmaya başlamak.

Gelecekteki bir bakış açısı olarak, csBN-MS tabanlı complexome profilleme protein kompleksi dinamikleri veya belirli biyolojik koşullarile ilgili değişiklikleri incelemek için çoklama için seçenekler sunar. Boyut dışlama tabanlı profilleme21 için önerilen metabolik olarak etiketlenmiş örneklerin birleşik ayrıştırılması basit görünse de, kullanılan ayrıştırmadan bağımsız olarak oluşan komplekslerde spontan alt birim değişimi engellenebilir Yöntem. Alternatif olarak, etiketli numuneler komşu jel şeritlerinde çözülebilir, bu da yüksek hassasiyet ve sağlamlıkla diferansiyel analiz için birlikte dilimlenebilir veya sindirim sonrası kombine edilebilir.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) – Project-ID 403222702 – SFB 1381 ve Almanya’nın Mükemmellik Stratejisi CIBSS – EXC-2189 – Project ID 390939984 tarafından desteklenmiştir. Katja Zappe’ye teknik yardım için teşekkür ederiz.

Materials

30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Bio Rad #1610158 Recommended for acrylamide gradient gel solutions up to 13%
30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 Bio Rad #1610154 Recommended for acrylamide gradient gel solutions >13%
SYPRO Ruby Protein Blot Stain Bio Rad #1703127 Total protein stain on blot membranes; sensitive and compatible with immunodetection
Coomassie Brilliant Blue G-250 Serva no. 35050 Centrifugate stock solutions prior to use
ComplexioLyte 47 Logopharm CL-47-01 Ready-to-use detergent buffer (1%) for mild solubilization of membrane proteins
Embedding Medium / Tissue Freezing Medium Leica Biosystems 14020108926 Embedding medium for gel sections to be sliced by a cryo-microtome
Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 µm Merck IPVH00010
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent GE Healthcare RPN2232
Plastic syringe with rubber stopper, 20-30 ml n.a. n.a. any supplier, important for making gel section embedding tool
broad razor blade n.a. n.a. any supplier, for BN-PAGE gel trimming / excision of lanes
metal tube / cylinder, ca. 4 cm long n.a. n.a. mold for embedding and freezing of gel samples
Protein LoBind Tubes, 1.5 ml Eppendorf Nr. 0030108116 highly recommended to minimize protein/peptide loss due to absorption
sequencing-grade modified trypsin Promega V5111
C18 PepMap100 precolumn, particle size 5 µm Dionex / Thermo Scientific P/N 160454
PicoTip emitter (i.d. 75 µm; tip 8 µm) New Objective FS360-75-8
ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 µm) Dr. Maisch GmbH r13.93. columns packed manually
rabbit anti-TPC1 antibody Gramsch Laboratories custom production described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
Cy3-biotinylated goat anti-rabbit IgG Vector Laboratories CY-1300 described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
biotinylated Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated Vector Laboratories #B1325 described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
cryo-microtome Leica CM1950 Leica Biosystems 14047743905
Mini Protean II Cell with wetblot unit Bio Rad n.a. for SDS-PAGE and Westernblot (not sold any more)
Penguin Midi Gel Electrophoresis System PeqLab n.a. for BN-PAGE (not sold any more)
Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera Zeiss / Photometrics n.a.
peristaltic pump (IP high precision multichannel) Ismatec ISM940 for casting of gradient polyacrylamide gels
gradient mixer with stirring (two chambers) selfmade, alternatively Bio Rad 1652000 or 1652001 for casting of gradient polyacrylamide gels, manual provides instructions to cast linear or hyperbolic gradient gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)
ultracentrifuge Sorvall M120 with S80 AT3 rotor Sorvall / Thermo Scientific n.a. for sample preparation (not sold any more)
UltiMate 3000 RSLCnano HPLC Dionex / Thermo Scientific ULTIM3000RSLCNANO
Orbitrap Elite mass spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMAZQ
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Majeran, W., et al. Consequences of C4 Differentiation for Chloroplast Membrane Proteomes in Maize Mesophyll and Bundle Sheath Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 7, 1609-1638 (2008).
  2. Wessels, H. J., et al. LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes. Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).
  3. Heide, H., et al. Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex. Cell Metabolism. 16 (4), 538-549 (2012).
  4. Wessels, H. J., et al. Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling. PLoS ONE. 8 (7), e68340 (2013).
  5. Wöhlbrand, L., et al. Analysis of membrane-protein complexes of the marine sulfate reducer Desulfobacula toluolica Tol2 by 1D blue native-PAGE complexome profiling and 2D blue native-/SDS-PAGE. Proteomics. 16 (6), 973-988 (2016).
  6. Takabayashi, A., et al. PCoM-DB Update: A Protein Co-Migration Database for Photosynthetic Organisms. Plant and Cell Physiology. 58 (1), e10 (2017).
  7. Senkler, J., et al. The mitochondrial complexome of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 89 (6), 1079-1092 (2017).
  8. de Almeida, N. M., et al. Membrane-bound electron transport systems of an anammox bacterium: A complexome analysis. Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (10), 1694-1704 (2016).
  9. Anand, R., Strecker, V., Urbach, J., Wittig, I., Reichert, A. S. Mic13 Is Essential for Formation of Crista Junctions in Mammalian Cells. PLoS ONE. 11 (8), e0160258 (2016).
  10. Eydt, K., Davies, K. M., Behrendt, C., Wittig, I., Reichert, A. S. Cristae architecture is determined by an interplay of the MICOS complex and the F1FO ATP synthase via Mic27 and Mic10. Microbial Cell. 4 (8), 259-272 (2017).
  11. Müller, C. S., et al. Cryoslicing Blue Native-Mass Spectrometry (csBN-MS), a Novel Technology for High Resolution Complexome Profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 669-681 (2016).
  12. Castonguay, J., et al. The two-pore channel TPC1 is required for efficient protein processing through early and recycling endosomes. Scientific Reports. 7 (1), 10038 (2017).
  13. Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19 (8), 1777-1783 (2000).
  14. Banyard, S. H., Stammers, D. K., Harrison, P. M. Electron density map of apoferritin at 2.8-A resolution. Nature. 271 (5642), 282-284 (1978).
  15. Dettmer, U., et al. Transmembrane protein 147 (TMEM147) is a novel component of the Nicalin-NOMO protein complex. The Journal of Biological Chemistry. 285 (34), 26174-26181 (2010).
  16. Kimberly, W. T., et al. Gamma-secretase is a membrane protein complex comprised of presenilin, nicastrin Aph-1, and Pen-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6382-6387 (2003).
  17. Hong, Y., et al. Human PIG-U and yeast Cdc91p are the fifth subunit of GPI transamidase that attaches GPI-anchors to proteins. Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1780-1789 (2003).
  18. Van Damme, T., et al. Mutations in ATP6V1E1 or ATP6V1A Cause Autosomal-Recessive Cutis Laxa. The American Journal of Human Genetics. 100 (2), 216-227 (2017).
  19. Budenholzer, L., Cheng, C. L., Li, Y., Hochstrasser, M. Proteasome Structure and Assembly. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3500-3524 (2017).
  20. Heusel, M., et al. Complex-centric proteome profiling by SEC-SWATH-MS. Molecular Systems Biology. 15 (1), e8438 (2019).
  21. Kristensen, A. R., Gsponer, J., Forster, L. J. A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome. Nature Methods. 9 (9), 907-919 (2012).

Tags

CsBN-MSProtein ComplexesMembrane ProteinsSignal TransductionNative Protein ComplexSubunit CompositionGradient GelPolymerizationLoading SlotsRunning BuffersProtein Solubilization

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Müller, C. S., Bildl, W., Klugbauer, N., Haupt, A., Fakler, B., Schulte, U. High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis. J. Vis. Exp. (152), e60096, doi:10.3791/60096 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image