High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis
Summary
Für die hochauflösende Complexome-Profilierung wird ein vielseitiges kryolicing BN-MS-Protokoll mit einem Mikrotom vorgestellt.
Abstract
Proteine üben in der Regel biologische Funktionen durch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen aus, entweder in dynamischen Proteinbaugruppen oder als Teil stabil geformter Komplexe. Letzteres lässt sich mit nativer Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) elegant nach molekularer Größe auflösen. Die Kopplung solcher Trennungen an die empfindliche Massenspektrometrie (BN-MS) ist gut etabliert und ermöglicht theoretisch eine erschöpfende Beurteilung des ausziehbaren Complexoms in biologischen Proben. Dieser Ansatz ist jedoch ziemlich mühsam und bietet eine begrenzte Auflösung und Empfindlichkeit in komplexer Größe. Auch, seine Anwendung ist auf reichlich mitochondriale und plastid Proteine beschränkt geblieben. So fehlen für die meisten Proteine noch Informationen über die Integration in stabile Proteinkomplexe. Präsentiert wird hier ein optimierter Ansatz für die komplexe Profilierung von Komplexen, die eine präparative BN-PAGE-Trennung, eine Submillimeter-Probenahme breiter Gelspuren durch Kryomikrotom-Schneiden und eine massenspektrometrische Analyse mit etikettenfreier Proteinquantifizierung umfassen. Die Verfahren und Tools für kritische Schritte werden ausführlich beschrieben. Als Anwendung beschreibt der Bericht komplexe Analyse einer solubilisierten endosome-angereicherten Membranfraktion aus Mausnieren, wobei insgesamt 2.545 Proteine profiliert werden. Die Ergebnisse zeigen die Identifizierung einheitlicher, überflussarmer Membranproteine wie intrazellulärer Ionenkanäle sowie hochauflösender, komplexer Protein-Montagemuster, einschließlich Glykosylierungs-Isoformen. Die Ergebnisse stehen im Einvernehmen mit unabhängigen biochemischen Analysen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode eine umfassende und unvoreingenommene Identifizierung von Protein-(Super-)Komplexen und deren Zusammensetzung der Untereinheit ermöglicht und eine Grundlage für die Untersuchung der Stoichiometrie, -montage und -interaktionsdynamik von Proteinkomplexen in biologisches System.
Introduction
Die BN-PAGE-Trennung wurde zunächst direkt an die LC-MS-Analyse (BN-MS) durch die Forschungsgruppen Majeran1 und Wessels2 gekoppelt, indem BN-PAGE-Gelspuren manuell getrennt wurden. Ihre Analysen identifizierten eine Reihe von reichlich vorhandenen Membranproteinkomplexen mit bekannter Untereinheitszusammensetzung aus Pflanzlichen Plasmiden bzw. HEK-Zellmitochondrien. Diese Analysen waren jedoch alles andere als umfassend und ließen keine unvoreingenommene Identifizierung neuartiger Versammlungen zu. Die Leistung von Massenspektrometern und etikettenfreien Quantifizierungsmethoden hat sich seitdem deutlich verbessert, was umfassende BN-MS-Analysen ermöglicht hat. Dies hat den Begriff “complexome profiling” geprägt. So analysierten Heide und Kollegen rattenherzige Mitochondrien, die 464 mitochondriale Proteine identifizierten und gruppierten, wodurch viele bekannte Baugruppen bestätigt wurden. Darüber hinaus fanden sie TMEM126B als eine neuartige und entscheidende Untereinheit eines spezifischen Montagekomplexes3. Vergleichbare Ergebnisse (mit 437 mitochondrialen Proteinprofilen) wurden in einer parallelen Studie mit HEK-Zellmitochondrien4erzielt.
Trotz dieser Verbesserungen sind mehrere Probleme geblieben, die das volle Potenzial von BN-MS für complexome Profiling einschränken. Eine wesentliche Einschränkung ist die effektive Größenauflösung von Komplexen, die durch zwei Faktoren bestimmt wird: die (i) Qualität der BN-PAGE-Trennung, die von der Homogenität des Gelmatrix-Porengradienten sowie der Stabilität/Löslichkeit der Probenkomplexe abhängt, und (ii) Schrittgröße der Gelprobenahme, die bestenfalls 1 mm beträgt, wenn herkömmlichemanuelles Schneiden5,6verwendet wird. Eine schlechte Größenauflösung verfehlt nicht nur subtile komplexe Isoformen und Heterogenitäten, sondern wirkt sich auch negativ auf den Dynamikumfang und das Vertrauen von unvoreingenommener, de novo Subunit-Zuweisung und Quantifizierung aus.
Weitere Herausforderungen sind die Präzision der Proteinquantifizierung und die Abdeckung des tatsächlichen Dynamikbereichs von Proteinüberfluss in der Probe durch massenspektrometrische Analyse. Daher ist die Anwendung von BN-MS-Komplexprofiling weitgehend auf biologische Proben mit geringerer Komplexität, hoher Expression von Zielkomplexen und günstigen Löslichkeitseigenschaften (d. h. Plastiden, Mitochondrien und Mikroorganismen)6,7,8,9,10.
Kürzlich haben wir kryomikrotome-slicing-assisted BN-MS (csBN-MS) eingeführt, die präzise Submillimeter-Probenahme von BN-PAGE-Gelspuren mit umfassender MS-Analyse und aufwendiger MS-Datenverarbeitung zur Bestimmung von Proteinprofilen mit hohem Vertrauen11. Die Anwendung auf eine mitochondriale Membranpräparation von Rattengehirnen zeigte bisher eine unerfüllte effektive komplexe Größenauflösung und maximale Abdeckung von oxidativen Atemkettenkomplexen (OXPHOS) (d. h. 90 von 90 MS-zugänglichen). In diesem Beispiel wurden auch eine Reihe neuartiger Proteinassemblys identifiziert.
Beschrieben werden hier optimierte Verfahren für die präparative BN-PAGE-Trennung von Proteinkomplexen (nicht auf eine bestimmte biologische Quelle beschränkt), das Gießen großer präparativer BN-PAGE-Gele, das Kryomikrotom-Schneiden breiter Gelspuren und MS-Daten. verarbeitung. Die Leistungsfähigkeit der hochauflösenden Profilierung wird für ein proteinkomplexes Präparat aus mit Mausnieren endosomeangereicherten Membranen demonstriert. Schließlich werden die Vorteile einer zunehmenden Auflösung und Präzision der massenspektrometrischen Quantifizierung diskutiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die vorgestellte Studie basiert auf der csBN-MS-Technik, die zuvor mit einer mitochondrialen Zubereitung11 bewertet wurde, und beinhaltete Verbesserungen bei der Probenvorbereitung, Gelverarbeitung und MS-Datenauswertung. Die fokussierte Analyse eines Abschnitts des großflächigen Separations-BN-PAGE-Gels lieferte einen umfassenden Satz von Daten, die Qualitätskennzahlen aufzeigten, die mit der Studie mit mitochondrialen Membranen vergleichbar sind. Massen- und Retentionszeitfehler sowie Lauf-zu-Lauf-Variationen wurden sehr gering gehalten und lieferten die Grundlage für die Bestimmung zuverlässiger Proteinhäufigkeitsprofile. Die Größenauflösung schien gut zu sein, mit halbmaximalen Spitzenbreiten von nur sechs Scheiben (entsprechend 1,5 mm, Abbildung 4) und relativen Größenunterschieden von weniger als 10 % gelöst (Abbildung 3, Abbildung 5A). Diese Werte entsprachen nicht vollständig der Größenauflösungsqualität der vorherigen csBN-MS-Analyse von Mitochondrien (trotz der ausgewählten kleineren Gel-Sampling-Schrittgröße), aber sie sind deutlich besser als die Leistung herkömmlicher BN-MS- oder Größenausschluss-MS nähert sich 20, die in letzter Zeit populär geworden sind.
Die Bedeutung einer hohen effektiven komplexen Größenauflösung wird durch das Simulationsexperiment in Abbildung 3 (mit DenPc1-assoziierten Komplexen) unterstrichen, das durch die 2D-BN/SDS-PAGE Western Blot-Analyse kaum aufgelöst werden kann (Abbildung 1B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das 0,25 mm-Schneiden in diesem Fall zu einigen Überstichproben geführt hat, aber es erwies sich dennoch als nützlich für die Beseitigung von “Quantifizierungsgeräuschen”, ohne die effektive Größenauflösung zu beeinträchtigen. Daher ist im Einklang mit den bisherigen Ergebnissen11generell eine Stichprobenstufengröße von 0,3 mm zu empfehlen.
Insbesondere die Diskriminierung von TPC1-assoziierten Komplexen geht mit 1 mm Gelprobenahme vollständig verloren, was die kleinste Schrittgröße ist, die durch manuelles Schneiden in herkömmlichen BN-MS5,6bereitgestellt wird. Dies könnte die Tatsache erklären, dass trotz der Bereitstellung leistungsfähiger MS-Technologien nur sehr wenige Proteinkomplexe und Untereinheiten de novo durch Complexome-Profiling identifiziert wurden. Neben seiner guten Auflösungsleistung bietet csBN-MS eine hohe Vielseitigkeit. Membrangebundene Komplexe und lösliche Proteinkomplexe von 50 kDa bis zu mehreren MDa können in einem einzigen Experiment mit minimaler Vorspannung effektiv gelöst werden11. Dies steht im Gegensatz zu alternativen Trenntechniken, die für komplexe Profilierungen wie Größenausschluss oder Ionenaustauschchromatographie verwendet werden, die mit Teilmengen löslicher Proteine mit bestimmten Größenbereichen oder Ladungseigenschaften arbeiten. Auf der anderen Seite ist csBN-MS weniger skalierbar (maximale Belastung von 3 mg Protein pro Gel), kann technisch anspruchsvoll sein und kann nicht automatisiert werden.
Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass csBN-MS-basiertes Complexome-Profiling erfolgreich auf nicht-mitochondriale Ziele angewendet werden kann, aber auch einige damit verbundene Herausforderungen aufzeigen. Daher erfordern eine effiziente Extraktion und biochemische Stabilität von Proteinkomplexen mehr Optimierung und Reinigungsschritte und können dennoch begrenzt sein. Innerhalb des untersuchten Größenfensters war die Anzahl der gut fokussierten, monodispersen Proteinkomplexe im Vergleich zu einer mitochondrialen Probe in der Tat deutlich geringer (Daten nicht dargestellt). Es wird auch empfohlen, die BN-PAGE-Probenlasten zu senken, um eine akzeptable Geltrennung zu erhalten. Höhere Belastungen erfordern möglicherweise breitere Gelspuren, die für das Schneiden schwieriger zu verarbeiten sind (siehe begleitendes Video). Darüber hinaus war die Proteinkomplexität der Proben höher (etwa zweifach) als die mitochondrienabgeleiteten Scheibenverdauten, was zu mehr fehlenden PV-Werten und einem reduzierten Dynamikbereich führte. Tatsächlich fehlten einige kleine Proteine, die zu den in Abbildung 5 dargestellten Komplexen gehören sollten, in den Analysen. Diese Probleme können in Zukunft durch den Einsatz schnellerer und sensiblerer MS-Instrumente oder datenunabhängiger Erfassungsmodi gelöst werden.
Die Probenvorbereitung ist sehr wichtig für die Protein-Komplex-Retrieval-, Stabilitäts- und Geltrennungsqualität. Parameter und Verfahren sollten für jedes Quellgewebe, Zelllysat, Membran (Fraktion) und Proteinkomplex von Interesse optimiert werden. Es werden die folgenden allgemeinen Empfehlungen bereitgestellt, die zur Erweiterung von Anwendungen von csBN-MS beitragen können:
i) Die Vorbereitung von Proben frisch und die Vermeidung von Erwärmung/Einfrieren, starke Verdünnungen, Änderungen der Pufferbedingungen und unnötige Verzögerungen;
ii) Verwendung von Puffern, die im Wesentlichen salzfrei sind (ersetzen durch 500-750 mM Betain oder Aminocaproinsäure), etwa einen neutralen pH-Wert und einen Gehalt an bis zu 1 % (w/v) nicht abbauendem Reinigungsmittel (Protein:Waschmittel-Verhältnis zwischen 1:4-1:10 für die Löslichkeit der Membran Proteinkomplexe, kein Reinigungsmittel für lösliche Proteinkomplexe erforderlich);
iii) Sorgfältige Prüfung und Anpassung der Waschmittelbedingungen durch analytische BN-PAGE, da diese die Effizienz komplexer Löslichkeit, Darstellung von Membranproteinkomplexen in der Probe, Stabilität und Homogenität der Protein-Waschmittel-Mizellen. Letztere sind Voraussetzungen dafür, dass Proteine sich als unterschiedliche Bänder/komplexe Populationen auf BN-PAGE-Gele konzentrieren. Frühere Literatur bietet eine breite Palette von neutralen Waschmitteln. DDM (n-dodecyl -d-maltoside)1,2,4,5,6 und digitonin3,5,7,8, 9,10,13,18 waren bisher die beliebtesten Wahlmöglichkeiten für BN-MS-Analysen. Es muss betont werden, dass jeder Waschmittelzustand notwendigerweise einen Kompromiss zwischen der Löslichkeitseffizienz und der Erhaltung von Proteinwechselwirkungen darstellt und möglicherweise nicht für alle Arten von Zielprotein und Ausgangsmaterial gleichermaßen geeignet ist;
iv) Entfernen geladener Polymere wie Fibrillen, Filamente, Polylysin, DNA und reichlich niedermolekulare Bestandteile (d. h. Metaboliten, Lipide oder Peptide). Dies kann durch Ultrazentrifugation, Gelfiltration oder Dialyse erreicht werden. Dies ist besonders wichtig für Gesamtzell- oder Gewebelysate;
v) Zugabe von Coomassie G-250 (Endkonzentration 0,05%-0,1%) und Saccharose (zur Erhöhung der Beladungsdichte, Endkonzentration 10%-20% [w/v]) zur Probe kurz vor dem Laden, um durch kurze Ultrazentrifugation zu löschen, die Probe ohne Störung zu beladen und den Lauf unmittelbar danach zu starten.
Als Zukunftsperspektive bietet csBN-MS-basiertes Complexome-Profiling Optionen für Multiplexing, um Protein-Komplexe Dynamiken oder Veränderungen im Zusammenhang mit spezifischen biologischen Bedingungen zu untersuchen. Die kombinierte Trennung von metabolisch gekennzeichneten Proben, wie sie für die größenausschlussbasierte Profilierung21 vorgeschlagen wird, erscheint einfach, kann jedoch durch einen spontanen Austausch von Untereinheiten in Komplexen behindert werden, die unabhängig von der verwendeten Trennung auftreten. system. Alternativ können markierte Proben in benachbarten Gelspuren gelöst werden, die dann für die Differentialanalyse mit hoher Empfindlichkeit und Robustheit mitgeschnitten oder kombiniert werden können.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) – Projekt-ID 403222702 – SFB 1381 und im Rahmen der Exzellenzstrategie CIBSS – EXC-2189 – Projekt-ID 390939984 unterstützt. Wir danken Katja Zappe für die technische Unterstützung.
Materials
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio Rad | #1610158 | Recommended for acrylamide gradient gel solutions up to 13% |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio Rad | #1610154 | Recommended for acrylamide gradient gel solutions >13% |
| SYPRO Ruby Protein Blot Stain | Bio Rad | #1703127 | Total protein stain on blot membranes; sensitive and compatible with immunodetection |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | Serva | no. 35050 | Centrifugate stock solutions prior to use |
| ComplexioLyte 47 | Logopharm | CL-47-01 | Ready-to-use detergent buffer (1%) for mild solubilization of membrane proteins |
| Embedding Medium / Tissue Freezing Medium | Leica Biosystems | 14020108926 | Embedding medium for gel sections to be sliced by a cryo-microtome |
| Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 µm | Merck | IPVH00010 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
| Plastic syringe with rubber stopper, 20-30 ml | n.a. | n.a. | any supplier, important for making gel section embedding tool |
| broad razor blade | n.a. | n.a. | any supplier, for BN-PAGE gel trimming / excision of lanes |
| metal tube / cylinder, ca. 4 cm long | n.a. | n.a. | mold for embedding and freezing of gel samples |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | Nr. 0030108116 | highly recommended to minimize protein/peptide loss due to absorption |
| sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| C18 PepMap100 precolumn, particle size 5 µm | Dionex / Thermo Scientific | P/N 160454 | |
| PicoTip emitter (i.d. 75 µm; tip 8 µm) | New Objective | FS360-75-8 | |
| ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 µm) | Dr. Maisch GmbH | r13.93. | columns packed manually |
| rabbit anti-TPC1 antibody | Gramsch Laboratories | custom production | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
| Cy3-biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | CY-1300 | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
| biotinylated Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated | Vector Laboratories | #B1325 | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
| cryo-microtome Leica CM1950 | Leica Biosystems | 14047743905 | |
| Mini Protean II Cell with wetblot unit | Bio Rad | n.a. | for SDS-PAGE and Westernblot (not sold any more) |
| Penguin Midi Gel Electrophoresis System | PeqLab | n.a. | for BN-PAGE (not sold any more) |
| Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera | Zeiss / Photometrics | n.a. | |
| peristaltic pump (IP high precision multichannel) | Ismatec | ISM940 | for casting of gradient polyacrylamide gels |
| gradient mixer with stirring (two chambers) | selfmade, alternatively Bio Rad | 1652000 or 1652001 | for casting of gradient polyacrylamide gels, manual provides instructions to cast linear or hyperbolic gradient gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf) |
| ultracentrifuge Sorvall M120 with S80 AT3 rotor | Sorvall / Thermo Scientific | n.a. | for sample preparation (not sold any more) |
| UltiMate 3000 RSLCnano HPLC | Dionex / Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMAZQ |
References
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