Metodo di elettroporazione per in vivo Consegna del DNA plasmide nel Telencephalon del pesce zebra adulto
Summary
Presentato qui è un metodo di elettroporazione per la consegna di DNA plasmide e l’etichettatura delle cellule ependymoglial nel telecefalo di pesce zebra adulto. Questo protocollo è un metodo rapido ed efficiente per visualizzare e tracciare singole cellule ependymoglial e apre nuove possibilità di applicare l’elettroporazione a un’ampia gamma di manipolazioni genetiche.
Abstract
L’elettroporazione è un metodo di trasfezione in cui un campo elettrico viene applicato alle cellule per creare pori temporanei in una membrana cellulare e aumentarne la permeabilità, consentendo così l’introduzione di diverse molecole nella cellula. In questo documento, l’elettroporazione viene utilizzata per introdurre il plasmidia alle cellule ependymoglial, che allineano la zona ventricolare del telencephalon del pesce zebra adulto. Una frazione di queste cellule mostra le proprietà delle cellule staminali e genera nuovi neuroni nel cervello del pesce zebra; Pertanto, studiare il loro comportamento è essenziale per determinare i loro ruoli nella neurogenesi e rigenerazione. L’introduzione di plasmidi tramite elettroporazione consente l’etichettatura e il tracciamento a lungo termine di una singola cellula ependymoglial. Inoltre, plasmidi come Cre ricombinase o Cas9 possono essere consegnati a singole cellule ependymoglial, il che consente la ricombinazione genica o l’editing genico e fornisce un’opportunità unica per valutare la funzione genica autonoma della cellula in un l’ambiente. Infine, questo protocollo dettagliato di elettroporazione passo-passo viene utilizzato per ottenere l’introduzione di successo di plasmidi in un gran numero di singole cellule ependymoglial.
Introduction
I pesci zebra sono eccellenti modelli animali per esaminare la rigenerazione cerebrale dopo una lesione da taglio. Rispetto ai mammiferi, sulla scala evolutiva, le specie meno evolute come il pesce zebra mostrano generalmente tassi più elevati di neurogenesi costitutiva e aree più ampie di residenza delle cellule staminali neurali adulte, portando a una generazione costante di nuovi neuroni in tutto la maggior parte delle aree cerebrali nella vita adulta. Questa caratteristica sembra correlare con una capacità rigenerativa significativamente più elevata del pesce zebra rispetto ai mammiferi1, poiché i pesci zebra hanno un notevole potenziale per generare in modo efficiente nuovi neuroni nella maggior parte dei modelli di lesioni cerebrali studiati2, 3,4,5,6,7,8. Qui, il telecefalo del pesce zebra è studiato, poiché è una zona del cervello con neurogenesi prominente in età adulta. Queste zone di neurogenesi adulta sono omologhe alle zone neurogeniche nel cervello dei mammiferi adulti9,10,11.
Abbondanti aree neurogeniche nel telencephalon del pesce zebra sono presenti a causa dell’esistenza di glia radiali come cellule o cellule ependymoglia. Le cellule ependymogliali agiscono come cellule staminali neurali adulte residenti e sono responsabili della generazione di nuovi neuroni sia nel cervello intatto che in quello rigenerante3,5. Esperimenti di tracciamento del lignaggio hanno dimostrato che l’ependymoglia ventricolare reagisce alle lesioni, quindi prolifera e genera nuovi neuroblasti che migrano al sito di lesione5. A causa della natura eversadela del telecefalo del pesce zebra, le cellule ependymogliali allineano la superficie ventricolare e costruiscono la parete ventricolare ventrale. La parete ventricolare dorsale è formata da uno strato di cellule ependymal dorsale (Figura 1A). È importante sottolineare che il pesce zebra ependymoglia incarna le caratteristiche della glia radiale dei mammiferi e delle cellule ependymal. I lunghi processi radiali sono una caratteristica tipica delle celle radiali glia, mentre le estensioni cellulari e le giunzioni strette (così come le loro posizioni ventricolari) sono caratteristiche tipiche delle cellule ependymal12,13,14. Pertanto, queste cellule sono indicate come cellule ependymoglial.
Per seguire il comportamento in vivo delle singole cellule ependymoglial durante la rigenerazione, devono essere etichettate in modo affidabile. Sono stati descritti in precedenza vari metodi di etichettatura cellulare in vivo per la microscopia fluorescente, come i giornalisti endogeni o i coloranti lipofili15. Questi metodi, a differenza dell’elettroporazione, possono richiedere periodi di tempo più lunghi e spesso non offrono la possibilità di etichettatura a cella singola o di tracciamento permanente a lungo termine. L’elettroporazione, tuttavia (oltre all’etichettatura a singola cellula), offre la possibilità di introdurre nuovo DNA nella cellula ospite. Inoltre, rispetto ad altri metodi di trasferimento del DNA nelle cellule, l’elettroporazione è stata dimostrata essere uno dei metodi più efficienti16,17,18,19.
Presentato qui è un protocollo di elettroporazione che è stato perfezionato allo scopo di etichettare singole cellule ependymoglial nel telecefalo di zebra per adulti. Questo protocollo consente l’etichettatura di singole cellule ependymoglial per seguirle per un periodo20 a lungo termine o per manipolare percorsi specifici in modo cellulare-autonomo21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo di elettroporazione è un metodo affidabile in vivo per etichettare le singole cellule ependymoglial. Il protocollo potrebbe essere necessario un ulteriore adattamento per etichettare altri tipi di cellule come neuroni o oligodendrociti. Per ottenere un’etichettatura di successo, è possibile utilizzare plasmidi contenenti diversi promotori. Pollo-beta actin promotore, eF1alpha, CMV e promotore di ubiquitina sono stati precedentemente utilizzati per guidare l’espressione di diversi transgeni in ependymo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Un ringraziamento speciale a James Copti per la modifica del manoscritto. Ringraziamo anche i finanziamenti a JN della Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) da parte dell’SFB 870 e dell’SPP “Integrative Analysis of Olfaction” e SPP 1738 “Ruoli emergenti di RNA non codificanti nello sviluppo di sistemi nervosi, plasticità e malattie”, SPP1757 ” L’eterogeneità gliale”, e la strategia di eccellenza nell’ambito del Cluster di Monaco per la Neurologia dei Sistemi (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN – 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
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