Reinigung des menschlichen S100A12 und seiner Ionen-induzierten Oligomere zur Immunzellstimulation

S100A12 ist ein Kalzium-bindendes Protein, das überwiegend von menschlichen Granulozyten produziert wird. Das Protein wird während (systemischer) Entzündungen überexprimiert und sein Serumspiegel, insbesondere bei (auto)entzündlichen Erkrankungen wie systemischer juveniler idiopathischer Arthritis (sJIA), familiärem Mittelmeerfieber (FMF) oder Kawasaki-Krankheit (KD) Krankheitsaktivität und Reaktion auf die Therapie. Abhängig von Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) wie gebührenähnlichen Rezeptoren (TLRs) kann das angeborene Immunsystem durch pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) wie Lipopolysaccharide (LPS) oder Schäden an assoziierten molekularen Mustern (DAMPs; auch als “Alarmins” bezeichnet). DAMPs sind endogene Moleküle wie zelluläre Proteine, Lipide oder Nukleinsäuren¹. DAMP-Funktionen sind für die Mitglieder der Calgranulin-Proteinfamilie, S100A8/A9 und S100A12², die auch als divalente metallionchelisierende antimikrobielle Peptide 3^{,4, 5,6}. Je nach verfügbarer Ionenstärke kann S100A12, wie andere Mitglieder der S100-Familie, in verschiedene Homomultimere einwirken und bis vor kurzem waren die Auswirkungen der S100A12-Oligomerisierung auf die PRR-Interaktion, insbesondere TLR4, unbekannt.

Die monomere Form des Proteins (92 Aminosäuren, 10,2 kDa) besteht aus zwei EF-Hand-Helix-Loop-Helix-Strukturen, die durch einen flexiblen Linker verbunden sind. Die C-Klemme EF-Hand enthält das klassische Ca²⁺-Bindungsmotiv, während die N-TerminalEF-Hand eine S100-proteinspezifische erweiterte Schleifenstruktur (‘pseudo-EF-hand’) aufweist und eine reduzierte Ca^{2+-Affinität}aufweist. Ca²⁺-Bindung durch S100A12 kann eine wesentliche konforme Veränderung des C-Terminusder Proteine induzieren, was zu einer Exposition eines hydrophoben Pflasters auf jedem Monomer führt und die Dimerisierungsschnittstelle bildet. So ist die kleinste quaternäre Struktur, die durch S100A12 gebildet wird, unter physiologischen Bedingungen ein nicht-kovalenter Dimer (ca. 21 kDa), in dem einzelne Monomere antiparallel ausgerichtet sind. Als Dimer angeordnet, wird S100A12 als Sequestrierung Zn²⁺ sowie andere divalente Metallionen, z.B. Cu²⁺ mit hoher Affinität⁷gemeldet. Diese Ionen werden an der Dimerschnittstelle S100A12 durch die Aminosäuren H15 und D25 einer Untereinheit und H85 sowie H89 der parallel enzierenden anderen Untereinheit^8,9,10koordiniert. Während frühere Studien nahelegten, dass Zn²⁺-geladene S100A12 die Organisation des Proteins in Homo-Tetramere (44 kDa) induzieren und zu einer erhöhten Ca²⁺-Affinität^11,12führen kann, Studien⁶ schlagen Ca²⁺-bindung durch S100A12 vor, um die Affinität des Proteins zu Zn²⁺zu erhöhen. Sobald die S100A12 EF-Zeiger von Ca²⁺voll belegt sind, wird angenommen, dass zusätzliche Ca²⁺ zwischen Dimeren binden und die Hexamerbildung auslösen (ca. 63 kDa). Die Architektur der hexamerischen Viertelstruktur unterscheidet sich deutlich von der des Tetramers. Es wird vorgeschlagen, dass die Tetramer-Schnittstelle unterbrochen wird, um neue Dimer-Dimer-Schnittstellen hervorzurufen, die der Hexamer-Bildung¹⁰zugute kommen. S100A12 wird fast ausschließlich von menschlichen Granulozyten ausgedrückt, wo es etwa 5% des gesamten zytosolischen Proteins¹³ausmacht. In seiner DAMP-Funktion wurde S100A12 historisch als Agonist des Multiligandenrezeptors für fortgeschrittene Glykationsendprodukte (RAGE) beschrieben, das damals als extrazelluläres neu identifiziertes RAGE-bindendes Protein (EN-RAGE)¹⁴bezeichnet wurde. Obwohl wir früher über biochemische S100A12-Bindung sowohl an RAGE als auch an TLR4¹⁵berichtet haben, haben wir kürzlich gezeigt, dass menschliche Monozyten auf S100A12-Stimulation in einer TLR4-abhängigen Weise reagieren¹⁶. Dies erfordert die Anordnung von S100A12 in seine Ca²⁺/Zn²⁺-induzierte hexamerische Viertelstruktur¹⁶.

Hier beschreiben wir ein Reinigungsverfahren für rekombinantes menschliches S100A12 und seine ioneninduzierten Oligomere für Immunzellstimulationen^16,17. Diese basiert auf einer zweistufigen Chromatographie-Strategie, die zunächst eine Anionenaustauschsäule umfasst, um das Protein zu isolieren und zu konzentrieren und Massenkontaminationen (z.B. Endotoxine/Lipopolysaccharide) zu entfernen¹⁸. Ionenaustauscher-Chromatographieharze trennen Proteine auf der Grundlage unterschiedlicher Netzoberflächenladungen. Bei sauren Proteinen wie S100A12 (isoelektrischer Punkt von 5,81) führt ein Puffersystem mit einem pH-Wert von 8,5 und einem starken Anionenaustauschharz zu einer guten Trennung. Gebundene Proteine wurden mit einem hohen Salzpuffergradienten eluiert. Mit einer Erhöhung der Ionenstärke konkurrieren negative Ionen im Elutionspuffer mit Proteinen um Ladungen auf der Oberfläche des Harzes. Proteine, die je nach Nettoladung einzeln elutieren, und dadurch ermöglichen die hier beschriebenen Puffer, das überexprimierte S100A12-Protein zu isolieren und zu konzentrieren. Aufgrund negativ geladener Gruppen in Lipopolysacchariden binden diese Moleküle auch an Anionenaustauschharze. Ihre höhere Nettoladung führt jedoch zu einer späteren Elution im aufgebrachten Hochsalzgradienten. Der zweite Schritt des Reinigungsverfahrens wurde zu Polierzwecken eingeführt. Dies nutzt die Calciumbindungsfähigkeit von S100A12 und entfernt restliche Verunreinigungen an einer hydrophoben Wechselwirkungssäule. Die Calciumbindung von S100A12 führt zu einer Konformationsänderung und einer Exposition hydrophober Flecken auf der Oberfläche des Proteins. Unter diesem Zustand interagiert S100A12 mit der hydrophoben Oberfläche des Harzes. Bei der Calcium-Chelatierung durch EDTA wird diese Wechselwirkung umgekehrt. In Gegenwart von Ionen, insbesondere Kalzium und Zink, ordnet S100A12 zu homomeren Oligomeren. Um Struktur-Funktions-Beziehungen der verschiedenen Oligomere zu untersuchen, stabilisierten wir dimer, tetramerische und hexamerische Rekombinante S100A12 mit einem chemischen Verklinker und trennten die Komplexe auf einer Farbtonographiesäule mit Größenausschluss. Um die Funktionalität und biologische Aktivität des gereinigten Proteins und seiner ioneninduzierten Oligomere zu analysieren, kann schließlich die Zytokinfreisetzung von S100A12 und LPS stimulierter Monozyten verglichen werden.

Verschiedene Methoden zur Reinigung von S100A12 wurden bisher beschrieben. Jackson et al.¹⁹veröffentlichten beispielsweise ein Protokoll mit Reinigung über eine Anionenaustauschsäule und eine anschließende Größenausschlusschromatographie. Das Feinpolieren an einer Größenausschlusssäule führt zu guten Ergebnissen, ist aber aufgrund der z. B. begrenzten Ladevolumina weniger flexibel in der Skalierbarkeit. Ein anderer Ansatz, veröffentlicht von Kiss et al.²⁰, beschreibt die Reinigung des markierten Proteins über Ni²⁺ Affinitätsspalte als ersten Reinigungsschritt, gefolgt von enzymatischer Spaltung, um das Tag zu entfernen und weitere Reinigungsschritte. Im Gegensatz zu den vorherzitierten Studien^19,20wird das in diesem Protokoll beschriebene produzierte Protein für Experimente an Immunzellen bestimmt. Daher ist eine Rest-Endotoxin-Kontamination aus der Bakterienkultur eine Herausforderung. Obwohl bisher unterschiedliche Ansätze zur Endotoxinentfernung beschrieben wurden, gibt es keine einheitliche Methode, die für eine gegebene Proteinlösung gleich gut funktioniert^21,22.

Zusammenfassend kombiniert unser Protokoll die Vorteile einer tagfreien Expression in einem bakteriellen System mit einer effizienten Endotoxinentfernung und einer hohen Ausbeute an reinem Protein.