Zuivering van de menselijke S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor Immuuncelstimulatie

S100A12 is een calcium bindend eiwit dat voornamelijk wordt geproduceerd door menselijke granulocyten. Het eiwit wordt overgedruct tijdens (systemische) ontsteking en de serumspiegels, met name bij (auto) ontstekingsziekten zoals systemische juveniele idiopathische artritis (sJIA), familiaire mediterrane koorts (FMF) of ziekte van Kawasaki (KD) kan informeren over ziekteactiviteit en respons op de therapie. Afhankelijk van patroonherkenning receptoren (PRRs) zoals Toll-achtige receptoren (TLRs), het aangeboren immuunsysteem kan worden geactiveerd door pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) zoals lipopolysacchariden (LPS) of schade geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs; ook wel ‘ alarmin ‘ genoemd). DAMPs zijn endogene moleculen zoals cellulaire eiwitten, lipiden of nucleïnezuren¹. Vocht-functies zijn goed beschreven voor de leden van de calgranulin proteïne familie, S100A8/A9 en S100A12², die ook worden gerapporteerd om te werken als divalente metalen Ion-chelerende antimicrobiële peptiden^{3,4, 5,6}. Afhankelijk van de beschikbare ionensterkte kan S100A12, net als andere leden van de S100-familie, verschillende homomultimers regelen en tot voor kort was de impact van S100A12-oligomerisatie op PRR-interactie, in het bijzonder TLR4, onbekend.

Het eiwit monomere vorm (92 aminozuren, 10,2 kDa) bestaat uit twee EF-hand Helix-lus-Helix structuren verbonden door een flexibele linker. De C-Terminal EF-hand bevat het klassieke CA^{2 +}-bindende motief, terwijl de N-terminale EF-hand een S100 eiwit-specifieke verlengde LUSSTRUCTUUR (‘ pseudo-EF-hand ‘) vertoont en een gereduceerde CA^{2 +}-affiniteit onthult. CA^{2 +}-binding door S100A12 kan leiden tot een belangrijke conformationele verandering in het C-terminus van de eiwitten, wat resulteert in blootstelling van een hydrofobe pleister op elk monomeer en vormt de door dimerisatie-interface. Zo is de kleinste Kwartaire structuur, gevormd door S100A12, onder fysiologische omstandigheden, een niet-covalente dimeer (ongeveer 21 kDa) waarin individuele monomeren in anti parallelle oriëntatie zijn. Wanneer gerangschikt als dimer, wordt S100A12 gerapporteerd aan onttrokken Zn^{2 +} en andere divalente metaalionen, bijvoorbeeld Cu^{2 +} met hoge affiniteit⁷. Deze ionen worden gecoördineerd op de S100A12 dimeer-interface door aminozuren H15 en D25 van een subeenheid en H85, evenals H89 van de anti-paralleling andere subeenheid^8,9,10. Terwijl eerdere studies voorstellen dat^{Zn 2 +}-loaded S100A12 de eiwit organisatie kan induceren in homo-tetramers (44 kDa) en resulteert in een verhoogde^{ca 2 +}-affiniteit^11,12, recente metaal titratie studies⁶ suggereren CA^{2 +}-binding door S100A12 om de eiwit affiniteit te verhogen tot Zn^{2 +}. Zodra de S100A12 EF-handen volledig bezet zijn door CA^{2 +}, wordt extra CA^{2 +} verondersteld te binden tussen dimers, triggering hexamer vorming (ongeveer 63 kDa). De architectuur van de hexamerische Kwartaire structuur verschilt duidelijk van die van de Tetramer. Er wordt voorgesteld dat de tetrameer-interface wordt verstoord om nieuwe dimer-dimer-interfaces te geven die de voordelen van hexamer-formatie¹⁰hebben. S100A12 wordt bijna uitsluitend uitgedrukt door menselijke Granulocyten, waar het ongeveer 5% van alle cytosolische eiwitten¹³vormt. In zijn VOCHTIGE functie werd S100A12 historisch beschreven als agonist van de multi-ligand receptor voor geavanceerde glycation end-producten (RAGE), dan genoemd extracellulaire nieuw geïdentificeerde RAGE-bindende proteïne (EN-RAGE)¹⁴. Hoewel we eerder meldden biochemische S100A12-binding aan zowel woede en TLR4¹⁵, we onlangs aangetoond menselijke monocyten om te reageren op S100A12 stimulatie op een TLR4-afhankelijke manier¹⁶. Dit vereist arrangement van S100A12 in zijn CA^{2 +}/Zn^{2 +}-geïnduceerde hexameer Kwartaire structuur¹⁶.

Hier beschrijven we een zuiverings procedure voor recombinant humaan S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor immuuncelstimulaties^16,17. Dit is gebaseerd op een tweestapschromatografie strategie, die in eerste instantie een anion-uitwisselings kolom bevat om het eiwit te isoleren en te concentreren en bulk verontreinigingen te verwijderen (bijv. endotoxinen/lipopolysacchariden)¹⁸. Ionenwisselingschromatografie harsen scheiden eiwitten op basis van verschillende netto oppervlakte heffingen. Voor zure eiwitten zoals S100A12 (isoelektrisch punt van 5,81), een buffersysteem met een pH van 8,5 en een sterke anionenwisselingshars leidt tot een goede scheiding. Gebonden eiwitten werden geellueerd met een hoogzout buffer gradiënt. Met een toename van Ionische kracht negatieve ionen in de elutie buffer concurreren met eiwitten voor ladingen op het oppervlak van de hars. Eiwitten individueel Elueer afhankelijk van hun netto-lading en in het resultaat daarvan, de buffers beschreven hierin laten toe om te isoleren en te concentreren de overexpressie S100A12 eiwit. Als gevolg van negatief geladen groepen in lipopolysacchariden, deze moleculen binden ook aan anion-uitwisseling harsen. Echter, hun hogere nettolading resulteert in latere elutie in de toegepaste hoogzout gradiënt. De tweede stap van de zuiverings procedure is ingevoerd voor polijst doeleinden. Dit maakt gebruik van het calcium bindings vermogen van S100A12 en verwijdert achtergebleven onzuiverheden op een hydrofobe-interactie kolom. Calcium binding van S100A12 leidt tot een conformationele verandering en een blootstelling van hydrofobe vlekken op het oppervlak van het eiwit. Op die voorwaarde communiceert S100A12 met het hydrofobe oppervlak van de hars. Bij calcium-chelaat door EDTA wordt deze interactie omgekeerd. In aanwezigheid van ionen, met name calcium en zink, regelt S100A12 de homomerische oligomeren. Om de structuur functie relaties van de verschillende oligomeren te bestuderen, stabiliseerde men dimeric, tetramere en hexameer recombinant S100A12 met een chemische als en scheidde de complexen op een grootte-uitsluitings chromatografie kolom. Tot slot, om de functionaliteit en biologische activiteit van het gezuiverde eiwit en de ionen-geïnduceerde oligomeren te analyseren, kan de cytokine-afgifte van S100A12 en LPS gestimuleerd monocyt worden vergeleken.

Verschillende methoden voor het zuiveren van S100A12 zijn tot nu toe beschreven. Jackson et al.¹⁹publiceerde bijvoorbeeld een protocol met zuivering via een anion-uitwisselings kolom en een daaropvolgende grootte-uitsluitings chromatografie. Het polijsten van zuivering op een kolom met grootte uitsluiting leidt tot goede resultaten, maar ― vanwege bijvoorbeeld beperkte laadvolumes ― is minder flexibel in schaalbaarheid. Een andere aanpak, gepubliceerd door Kiss et al.²⁰, beschrijft de zuivering van gelabelde eiwitten via ni^{2 +} affiniteits kolom als de eerste zuiveringsstap, gevolgd door enzymatische splitsing om de tag en verdere zuiveringsstappen te verwijderen. In tegenstelling tot de avooropgestelde studies^19,20, wordt het geproduceerde eiwit zoals beschreven in dit protocol bepaald voor experimenten met immuuncellen. Daarom is restant endotoxine besmetting van bacteriële cultuur een uitdaging. Hoewel er tot dusver verschillende benaderingen voor de verwijdering van endotoxine zijn beschreven, is er geen uniforme methode die even goed werkt voor een bepaalde eiwit oplossing^21,22.

Kortom, ons protocol combineert de voordelen van een tagvrije expressie in een bacterieel systeem met efficiënte endotoxine verwijdering en hoge opbrengst van zuivere eiwitten.