Summary

모리스 워터 미로를 이용한 알츠하이머 병 마우스 모델의 학습 및 기억 능력 분석

Published: October 29, 2019
doi:

Summary

본 명세서에서, 알츠하이머병 모델 마우스의 학습 및 기억 능력을 평가하고 이를 치료하기 위한 수동 침술의 효과를 평가하기 위한 모리스 수질 미로 시험을 수행하는 프로토콜이 기재되어 있다.

Abstract

모리스 물 미로 (MWM) 실험은 실험 동물이 수영하고 물에 숨겨진 플랫폼을 찾는 법을 배워야강제로. 그것은 널리 학습과 동물의 메모리를 평가하기 위해 과학 연구에서 사용된다. MWM 테스트의 광범위한 사용으로 인해, 시각적 실험 프로토콜은 연구자에 필수적이다. 이 원고는 MWM 테스트의 프로토콜을 소개하기 위해 최신 연구를 사용합니다. 알츠하이머 병 (AD)은 기억력과 인지 기능의 점진적 인 손실을 특징으로합니다. AD에 사용되는 대안및 보완 치료는 수동 침술 (MA)입니다. AD 모델 마우스의 학습 및 기억 능력을 평가하기 위해 MWM 테스트를 실시하였다. MWM의 가시적 플랫폼 시험, 숨겨진 플랫폼 시험, 프로브 시험 및 반전 시험을 사용하여 공간 학습 및 메모리 능력을 평가했습니다. 가시적인 플랫폼 시험에서, 다른 그룹에서 마우스의 수영 속도 및 탈출 대기 시간은 크게 다르지 않았다. 숨겨진 플랫폼과 반전 시험에서 AD 그룹은 긴 탈출 대기 시간을 보였습니다. 이스케이프 레이턴시MA 처리 후 현저히 감소하였다. 낮은 플랫폼 크로스오버 수 및 프로브 시험에서 SW 사분면에서의 시간 비율은 MA 처리 후 증가하였다(p&0.05 또는 p< 0.01). MWM 테스트의 결과는 MA가 AD 모델 마우스의 공간 학습 및 기억 능력을 효과적으로 향상시킬 수 있음을 시사합니다. 엄격한 실험 작업을 통해 결과의 신뢰성을 보장했습니다.

Introduction

현재, MWM 실험은 동물의 공간 학습 및 기억을 평가하기 위해 가장 널리 사용되고 표준 행동 실험이되고있다1. 그것은 처음에 영국 심리학자 리처드 G. 모리스에 의해 설계 되었으며 지속적으로 개선 되었습니다. 최소한의 훈련, 종 간 유틸리티, 체중 차이에 대한 무감각, MWM의 반복 테스트 능력과 같은 많은 장점은 인지 기능을 평가하는 가장 좋은 방법입니다2. 알츠하이머 병 (AD)은 주로 메모리 처리 및 인지 기능의 감소를 특징으로하는 주요 의료 문제입니다3. MWM은 AD 모델 동물의 학습 및 기억 능력과 내정간섭 방법의 효과를 평가하는 데 필수적인 실험 수단이다. MWM 실험은 일반적으로 시간이 많이 소요되며(6-11일) 많은 가변 인자를수반합니다 4. 물 미로 실험에 대 한 많은 기사가 있지만, 실제로, 연구원은 일관 된 프로토콜 부족. 따라서 직관적이고 엄격한 프로토콜 프로세스 비디오가 특히 중요합니다. 이전 실험을 예로5로사용하여 MWM의 모든 단계를 설명합니다. MWM을 사용하여, 이전 연구는 침술이 AD 모형 마우스5,6,7의현상을 구호할 수 있었다는 것을 건의했습니다 .

본 명세서에서, 최근 연구에서 사용된 MWM 프로토콜5는 연구자들이 AD 모델 동물의 공간 학습 및 기억을 평가하기 위한 간단하고 가시적인 방법을 제공하기 위해 기술된다.

Protocol

이 프로토콜은 중국 의학 대학의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었으며, 중국의 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 모든 지침에 따라. 실험 절차 도중 우발적인 죽음 상황이 없었고, 이 연구에서 안락사될 필요가 없는 동물도 없었습니다. 1. 준비 구매 30 남성 SAMP8 마우스와 10 남성 SAMR1 마우스 (나이: 8 개월). 24°C의 온도와 12시간 의 어두운/빛 주기에서 개별 환기 케이지에 마우스를 개별적으로 보관하십시오. 표준 펠릿 다이어트 사용 가능한 광고 리비툼으로 마우스를 공급하고 멸균 식수를 제공합니다. 모든 마우스를 실험 전 5일 동안 환경에 적응시다. 2. 동물의 그룹화 무작위로 30 SAMP8 마우스를 세 그룹 (n = 10 / 그룹)으로 나눕니다 : AD 그룹, 수동 침술 (MA) 그룹 및 의학 (M) 그룹. 10개의 SAMR1 마우스를 정상 대조군(N) 군6으로사용한다. 3. 도네페질 염산염 정제의 관리 도네페질 염산염 정제(5 mg/정제)를 분쇄하고 증류수 50 mL에 녹입니다. MA 치료 및 MWM 검사가 수행되는 날을 포함하여 전체 실험 동안 하루에 한 번경구 을 사용하여 마우스에 1 mg / kg의 용량으로 3.1 단계로 준비 된 약을 전달하십시오. 4. 수동 침술의 관리 마우스 백에 MA 군의 마우스를 고정시. 일회용 멸균 침술 바늘 (0.25 mm x 13mm)을 사용하고 20 분 동안 코쪽으로 바이후이 (GV20)와 인탕 (GV29)5에 MA의 평평한 가시 방법을 적용하십시오. MA 치료 및 MWM 검사가 수행되는 날을 포함하여 전체 실험 동안 매번 ~ 15s마다 약 180 r /min의 속도로 90 ° 이내의 조작을 양방향으로 돌이킵니다. 5. MWM 테스트 참고: 15일 연속 치료 후 24시간에서, 4개의 그룹에서 마우스를 MWM 시험으로 대상화하였다. 가시적인 플랫폼 평가판, 숨겨진 플랫폼 평가판, 프로브 재판 및 반전 시험을 순서대로 수행합니다. MWM 테스트를 준비합니다. MWM 장치와 신호 수집 및 처리 시스템을 방음 유지하도록 설계된 실험실에 배치합니다. MWM 장치 중간에 불투명 한 천으로 둘러싸인 원형 흰색 탱크 (직경 = 90cm, 높이 = 50cm)를 넣습니다. 비디오 카메라를 MWM 장치의 천장에 고정하고 자동화된 추적 시스템을 사용하여 비디오 레코더에 연결하여 데이터를 수집합니다. 물 미로 탱크를 두 개의 상호 수직 선을 사용하여 동일한 4개의 동일한 영역으로 나누어 북쪽(N), 남쪽(S), 동쪽(E) 및 서쪽(W)으로 표시합니다. 풀 영역을 개념적으로 동일한 크기의 네 개의 사분면(NE, NW, SW 및 SE)으로 나눕니다. 마우스 의 시야 내에서 각 사분면의 벽에 서로 다른 모양의 시각적 단서를 시각적 참조(예: 사각형, 삼각형 및 원)로 배치합니다.참고: 말단 신호는 플랫폼을 찾기 위한 동물의 탐색 참조 지점입니다. 따라서 테스트 중에 이동하지 마십시오. 연구원의 위치는 잠재적인 말단 단서이며 MWM에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 연구원은 동물이 시험을 능력을 발휘하기 위하여 기다리는 동안 마우스의 시야에서 머물러야 합니다. 원형 탱크를 30cm 깊이로 물로 채우고 전기 히터로 22 ± 2 °C에서 유지하십시오. 약 150g의 분유로 물을 불투명하게 만듭니다. 표시되는 플랫폼 평가판을 수행합니다. 플라스틱 원형 플랫폼(직경 = 9.5cm, 높이 = 28cm)을 임의의 사분면에 수면 위에 1cm 위에 놓습니다. 플랫폼에 검은 깃발을 놓습니다. 탱크 벽을 마주보고있는 네 개의 시작 위치 중 하나에서 수위에서 물에 각 마우스를 부드럽게 해제합니다. 마우스를 물에 떨어뜨리지 마십시오. 마우스가 물에 방출되는 즉시 컴퓨터 추적 프로그램을 활성화합니다. 플랫폼을 검색하기 위해 각 마우스 60s를 제공합니다. 각 평가판이 끝나면 각 마우스를 플랫폼에 놓고 10-30초에 마우스를 계속 사용할 수 있습니다. 컴퓨터에서 마우스의 수영 궤적을 관찰하고 마우스가 플랫폼을 탈출 대기 시간으로 찾는 데 걸린 시간을 기록하고 수영 속도를 분석합니다. 수건으로 각 마우스를 건조하고 전기 히터로 따뜻하게. 동물이 과열되지 않도록 적절한 열원을 사용하십시오.참고: 각 마우스를 4개의 다른 시작 사분면 각각에 풀에 놓고, 이후의 각 시험과 함께 플랫폼을 다른 위치로 이동합니다. 각 마우스를 사용하는 두 시험 사이의 간격은 15-20 분입니다. 숨겨진 플랫폼 평가판/장소 탐색 테스트를 수행합니다. SE 사분면에 플래그없이 동일한 플랫폼을 배치합니다. 네 개의 사분면(NE, NW, SW, N)에서 4개의 시험을 위해 풀 벽을 마주보고 있는 각 사분면에서 마우스를 무작위로 풀에 놓습니다. 두 번의 시험 사이에 15-20분의 시간 간격을 사용하십시오. 숨겨진 플랫폼을 검색하기 위해 각 마우스 60s를 제공합니다. 후속 분석을 위해 마우스가 플랫폼으로 올라간 후 각 시험의 이스케이프 대기 시간을 기록합니다. 수건으로 각 마우스를 건조하고 전기 히터로 따뜻하게.참고: 2일부터 6일까지 숨겨진 플랫폼 평가판을 실시합니다. 마우스가 60s에서 플랫폼을 찾을 수없는 경우, 플랫폼까지 올라 가서 각 시험의 끝에 10-30s에 머물 수 있도록 마우스를 리드. 플랫폼과 일정한 위치에서 시각적 단서를 통해 5일 동안 각 마우스에 대해 하루에 4회 시험을 수행합니다. 프로브 시험을 수행합니다.참고: 새로운 시작 위치에서 풀에 있는 각 마우스를 찾아 마우스의 공간 탐색 능력을 관찰합니다. 플랫폼을 제거합니다. 60s에 대해 한 번 풀에서 탱크 벽을 향한 각 마우스를 찾습니다. 미로에서 수영 거리, 수영 속도 및 플랫폼 크로스 오버 번호를 기록합니다. 각 마우스를 수건으로 말리고 시험 후 따뜻함을 제공합니다. 반전 시험을 수행합니다.참고: 8-11일부터 반전 시험을 수행합니다. SE 사분면 대신 NW 사분면 중간에 플랫폼을 배치합니다. 숨겨진 플랫폼 평가판 섹션에 자세히 설명된 대로 5.3.2 -5.3.5 단계를 따르십시오. 6. 통계분석 통계 분석을 수행하려면 통계 소프트웨어(예: SPSS 20.0)를 사용합니다.

Representative Results

이 프로토콜의 시간 축 다이어그램은 그림 1에나와 있습니다. 그림 1: 스터디 프로토콜의 시간 축 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 시간 축은 이 실험이 총 21일 동안 지속되었다는 것을 보여줍니다. 치료는 전체 실험 동안 마우스에 적용되었고 MWM 시험은 15일 의 치료 후에 시작되었다. 가시플랫폼, 숨겨진 플랫폼, 프로브, 반전 시험이 순서대로 진행되었습니다. Ding 등5에서 이전에 게시 된 결과는 MWM 도 2의전형적인 결과로 제시됩니다. 도 2: 모리스 물 미로 시험의 전형적인 결과(n=10). (A)가시 플랫폼 시험에서 다른 그룹 들 사이에서 쥐의 탈출 대기 시간 및 수영 속도의 변화. (B)숨겨진 플랫폼과 반전 시험에서 다른 그룹 중 쥐의 탈출 대기 시간의 변화. p-값은 대조군과 비교하여 *p< 0.05 및 **p< 0.01입니다. 기호 ##는 AD 그룹과 비교하여 p< 0.01을 나타냅니다. (C)플랫폼 크로스오버 수의 변화와 프로브 시험에서 상이한 실험군 들 사이에서 북서부 사분면에서 쥐가 보낸 시간의 백분율이다. 각 그룹에서 가시플랫폼, 숨겨진 플랫폼 및 반전 시험의 결과가 도시된다(n=10, 평균 ±SD). 이 그림은 딩 외5에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2A는 가시플랫폼 평가판의 결과를 나타낸다. MWM 의 첫날에 그룹 간의 탈출 대기 시간 또는 수영 속도에서 통계적 차이는 관찰되지 않았다. 도 2B는 2-6 일 및 8-11 일로부터 숨겨진 플랫폼 및 반전 시험의 결과를 나타낸다. AD 그룹의 이스케이프 레이턴시(escape late)는 시험 의 날마다 높은 수준에 머물렀다. 다른 세 그룹의 탈출 대기 시간은 점차 감소하였다. 3일-6일 및 8-11일로부터의 탈출 대기 시간은 대조군(p< 0.01)보다 AD 군에서 더 길어졌다. MA 및 약물 군에서 마우스의 탈출 대기는 각각 2-6일 및 8-11일에 AD 군에서 마우스의 그보다 짧하였다(p< 0.01). 도 2C는 프로브 시험의 결과를 나타낸다. AD 군에서 의 플랫폼 크로스오버 마우스 수는 대조군(p< 0.01)보다 통계적으로 낮았다. MA 그룹의 플랫폼 크로스오버 수는 AD 그룹(p< 0.05)보다 높았다. AD 군에서 마우스에 의한 SW 사분면에서 소요된 시간의 비율은 대조군(p< 0.01)보다 현저히 낮았다. MA 그룹의 SW 사분면에서 소요된 시간의 비율은 AD 그룹(p< 0.01)보다 높았습니다.

Discussion

비엘 워터 미로와 신시내티 물 미로를 포함한 많은 물 미로가 적어도 한 세기 동안 주변에 있었지만 MWM만이 공간 학습 및 기억 능력을 효과적이고 객관적으로 평가하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 장점9. MWM을 광범위하게 사용했음에도 불구하고 절차가 항상 최적으로 사용되는 것은 아닙니다. MWM 실험은 일반적으로 시간이 오래 걸리며 많은 변수 요인의 영향을 받습니다. 고려해야 할 공간 학습 및 메모리 능력의 변화를 감지하는 데 도움이 몇 가지 효과적이고 신뢰할 수있는 측면이 있습니다.

4개의 다른 MWM 시험이 수행되었다. 눈에 보이는 플랫폼 시험은 MWM의 첫 날에 사용되었습니다. 동물이 플랫폼에 직접 수영 할 수 있다면, 그것은 동물의 수영 능력과 비전이 정상 이었다는 것을 나타냈다10. Otnass는 가시적 인 플랫폼 시험을 먼저11을 실시해야한다고 제안했습니다. 이 연구에서 가시적인 플랫폼 시험의 결과는 4개의 그룹이 동일한 학습 수준에서 시작되었다는 것을 의미했습니다. 거기에서, 연속적인 실험을 시작할 수 있었습니다. 숨겨진 플랫폼 시험은 학습 및 기억 능력을 획득하는 마우스의 능력을 평가하는 데 사용되었다. 프로브 재판은 숨겨진 플랫폼 재판이 끝난 후 7 일, 24 시간 동안 수행되어 작업 기억을 평가했습니다. 마지막으로, 반전 재판은 작업 메모리를 평가하는 데 사용되었다2. MWM의 4개의 다른 예심에 있는 변경은 AD 모형 마우스가 낮은 학습 및 기억 능력을 가지고 있고 MA가 AD5에긍정적인 효력이 있었다는 것을 표시했습니다.

풀 및 플랫폼1의크기에 대한 특정 표준은 없습니다. 대부분의 MWM 연구에서는 214cm 직경의 수영장이 사용됩니다. Vorhees와 윌리엄스는 동일한 프로토콜을 사용하면 쥐가 210cm 풀보다 122cm 풀에서 더 빨리 배울 수 있음을 보여주었습니다. 학습 곡선의 가파른 경사면은 122cm 직경의 수영장이 쥐가12를탐색하기가 매우 쉽다는 것을 나타냅니다. 현재 프로토콜에서는 AD 마우스의 노년및 약한 키를 고려하여, 직경 90cm 풀 및 9.5cm 직경 플랫폼을 사용하였다. 예비 실험의 결과는 마우스가 더 큰 직경 풀에 있는 플랫폼을 찾는 더 어려움이 있었다는 것을 표시했습니다. 따라서 큰 풀의 테스트는 그룹 간의 실제 차이를 나타내지 않습니다. 실험 동물은 더 작은 플랫폼4와더 큰 수영장에서 플랫폼을 찾는 데 어려움을 겪었습니다. 따라서, 풀과 플랫폼의 크기는 실험 동물의 실험 요건 및 상태에 따라 예비 실험에서 최적화되어야 한다.

MWM 테스트4를수행하기 위해 20-24 °C범위의 온도에서 물을 권장합니다. 노인 실험동물은냉수(13)에서저조한 수행을 보였으며, 이는 체온조절(14)의 명확한 연령 의존적 손실을 나타낸다. 본 연구에서, 온도 조절기는 20-24°C에서 물의 온도를 유지하기 위해 풀의 바닥에 배치되었다. 연구 결과는 4개의 단 중 수영 속도에 있는 유의한 다름을 보여주지않았습니다 5.

MWM은 인지 기능을 평가하는 강력한 기술이며 현재 연구에 널리 사용됩니다. 그러나, 풀 및플랫폼(15,16)의크기를 포함하는 MWM 테스트를 수행하기 위한 정의된, 표준, 일관된 장비는 없다. 실험실마다 MWM에 대한 사양이 다릅니다. 따라서, 연구원은 그들의 개별적인 실험 적인 요구 사항에 따라 적절 한 실험 장치를 선택, 연구자 들 사이 혼란을 일으킬 수 있는. 예비 실험도 필요합니다. MWM 같은 기본 실험에 더 많은 연구를 실시 해야. 현재, 실험 적 도구로서의 MWM의 유연성은 목적된 연구에 따라 기본 프로토콜을 선택하는 능력에있다. 따라서, 이 시험은 더 깊이 있는 인지 기능을 평가하기 위하여 적용될 수 있습니다.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

후일링 티안과 닝 딩은 공동 첫 번째 저자입니다. 지강 리와 징장은 공동 저자입니다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (그랜트 번호 81804178, 81473774, 및 81503654)에서 보조금에 의해 지원되었다. 본 명세서에 기술된 프로토콜 및 결과는 “수동 침술의 참여는 알츠하이머 병의 SAMP8 마우스 모델에서 행동과 대뇌 혈류를 조절한다”는 기사에서 유래했다.

Materials

acupuncture needles Beijing Zhongyan Taihe Medical Instrument Limited Company 511526
desktop computer Chengdu Techman Software Limited Liability Company Lenovo T4700D
Donepezil Hydrochloride Tablet Eisai China H20050978 Aricept
mice Zhi Shan (Beijing) Academy of Medical Science SCXK2014-0003
Mirros water maze device Chengdu Techman Software Limited Liability Company WMT-100S
mouse bags home-made
Signal acquisition and processing system Chengdu Techman Software Limited Liability Company BL-420N

References

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Citer Cet Article
Tian, H., Ding, N., Guo, M., Wang, S., Wang, Z., Liu, H., Yang, J., Li, Y., Ren, J., Jiang, J., Li, Z. Analysis of Learning and Memory Ability in an Alzheimer’s Disease Mouse Model using the Morris Water Maze. J. Vis. Exp. (152), e60055, doi:10.3791/60055 (2019).

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