Störende Endothelial Biomechanik über Connexin 43 Strukturelle Störung

Das Feld, das sich auf die Untersuchung der Auswirkungen physikalischer Kräfte und mechanischer Eigenschaften auf die Zell- und Gewebephysiologie und Pathologie bezieht, ist als Mechanobiologie¹bekannt. Ein paar nützliche Techniken, die in der Mechanobiologie verwendet wurden, sind Monolayer-Stressmikroskopie und Traktionskraftmikroskopie. Die Traktionskraftmikroskopie ermöglicht die Berechnung von Traktionen, die an der Zell-Substrat-Schnittstelle erzeugt werden, während die monoschichtige Spannungsmikroskopie die Berechnung interzellulärer Spannungen ermöglicht, die zwischen benachbarten Zellen innerhalb einer Monoschicht erzeugt werden^{2 ,3,4,5,6}. Die Ergebnisse früherer Methoden deuten darauf hin, dass zellabgeleitete mechanische Spannungen eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung des Schicksals einer Vielzahl zellulärer Prozesse^{spielen 3,4,5}. Wenn z. B. eine externe mechanische Kraft ausgesetzt wird, kann eine Gruppe von Zellen, die als Kollektiv migrieren, ihre Morphologie verändern und ihre Form polarisieren, um die Richtung der angewendeten Kraft auszurichten und zu migrieren, indem sie teilweise Traktionen erzeugen^{7, 8}. Traktionen bieten eine Metrik, die zur Bewertung der Zellkontraktilität verwendet werden kann und mittels Traktionskraftmikroskopie (TFM) berechnet wird. Die Traktionskraftmikroskopie (TFM) beginnt mit der Bestimmung zellinduzierter Substratverformungen, gefolgt von der Berechnung des Traktionsfeldes unter Verwendung eines mathematisch strengen, mechanikbasierten Berechnungsansatzes. Da die Fähigkeit, Traktionen zu berechnen, schon seit geraumer Zeit besteht, haben Forscher TFM genutzt, um die Auswirkungen von Traktionen auf eine Vielzahl von Prozessen zu offenbaren, einschließlich Krebs^9,Wundheilung¹⁰ und Bewertung von technischen Herz Gewebe¹¹.

Die Implementierung von TFM und MSM kann in drei wesentliche Schritte unterteilt werden, die in der folgenden Reihenfolge ausgeführt werden müssen: Erstens werden die von den Zellen erzeugten Hydrogelverformungen bestimmt; zweitens werden Traktionen aus Hydrogelverformungen zurückgewonnen; und drittens wird ein Finite-Elemente-Ansatz verwendet, um normale und scherende interzelluläre Spannungen innerhalb der gesamten Monolayer zu berechnen. Um Gelverschiebungen zu berechnen, wurden Fluoreszenzperlenbilder mit Zellen mit dem Referenzperlenbild (ohne Zellen) verglichen, indem eine benutzerdefinierte Partikelbild-Velocimetrie (PIV)-Routine verwendet wurde. Die Kreuzkorrelationsfenstergröße und -überlappung für die PIV-Analyse wurden für 32 x 32 Pixel bzw. 0,5 ausgewählt. Zu diesem Zeitpunkt wurden Pixelverschiebungen in Mikrometer umgewandelt, indem sie mit einem Pixel-zu-Mikron-Umrechnungsfaktor multipliziert wurden (für unser Mikroskop beträgt dieser Umrechnungsfaktor 0,65), um Verschiebungen in der Ebene zu erhalten. Fehler, die mit dem Ignorieren von Verschiebungen a-ebener Weise verbunden sind, sind vernachlässigbar^12,13. Nach der Berechnung von Gelverschiebungen gibt es zwei Arten von Traktionsmessungen, die verwendet werden können, eingeschränkte Traktionen und uneingeschränkte Traktionen^8,14. Unbeschränkte Traktionen stellen das Traktionsfeld für das gesamte Sichtfeld (einschließlich Regionen mit und ohne Zellen) bereit, während eingeschränkte Traktionen das Traktionsfeld nur für Regionen bereitstellen, die Zellen¹⁴enthalten. Anschließend werden interzelluläre Spannungen mittels Monolayer-Stressmikroskopie (MSM) berechnet, was eine Erweiterung der Traktionskraftmikroskopie darstellt. Die Implementierung von MSM basiert auf der Annahme, dass lokale Traktionen, die von einer Monoschicht von Zellen an der Zell-Substrat-Schnittstelle ausgeübt werden, durch mechanische Kräfte ausgeglichen werden müssen, die zwischen den Zellen an der Zell-Zell-Schnittstelle übertragen werden, wie es in Newtons Gesetzen gefordert wird^{7 ,12,13}. Eine wichtige Annahme ist dabei, dass die Zellmonoschicht als dünnes elastisches Blatt behandelt werden kann, da die Traktionsverteilung in der Monoschicht bekannt ist und die Kraftbalance nicht von den Zellmaterialeigenschaften abhängt. Eine weitere wichtige Annahme ist, dass die Zugkräfte durch lokale interzelluläre Spannungen innerhalb des optischen Sichtfeldes (innerhalb der Monoschicht) ausgeglichen werden und der Einfluss dieses Kraftgleichgewichts im distalen Bereich (außerhalb der Monolayer) minimal ist¹³. Daher sind die Randbedingungen, die durch interzelluläre Spannungen, Verschiebungen oder eine Kombination aus beidem an der Einschichtgrenze definiert sind, entscheidend für die Ausführung von MSM¹³. Unter Berücksichtigung der oben genannten Informationen verwenden wir MSM, um eine Finite-Elemente-Analyse (FEM) durchzuführen, um die maximale Hauptspannung_(max.) und die minimale Hauptspannung_(min) durch Drehen der Spannungsebene an jedem Punkt innerhalb des Monolayer. Diese Hauptspannungen werden anschließend verwendet, um die durchschnittliche durchschnittliche normale interzelluläre Spannung von 2D [(max +_min) /2] und die maximale 2D-Scherspannung_[(max –_min) /2] innerhalb der gesamten Monolayer zu berechnen. ^12,13. Dieses Verfahren wird von Tambe et al.^12,13 näher beschrieben.

Die Monolayer-Stressmikroskopie (MSM) ermöglicht die Berechnung von zellzellulären Spannungen, die in einer Monoschicht^6,7,^8,12,13erzeugt werden. Diese interzellulären Spannungen wurden vorgeschlagen, wichtig für Gewebewachstum und -reparatur, Wundheilung und Krebsmetastasen^12,15,16,17zu sein. Darüber hinaus wurden interzelluläre Spannungen vorgeschlagen, auch bei der Endothelzellmigration und endotheliale Barrierefunktion^17,18wichtig zu sein. Während Zell-Zell-Kreuzungen wie enge Kreuzungen und Adhäsivverbindungen beide als eine entscheidende Rolle bei der erzeugung und Transmission von endothelialen interzellulären Spannungen vorgeschlagen wurden, bleibt die Rolle von Spaltknoten schwer fassbar. Lückenknoten verbinden benachbarte Zellen physisch und bieten einen Weg für elektrischen Strom und Moleküle (<1 KDa), um zwischen benachbarten Zellen^19,20,21zu passieren. Obwohl Endothelzellen Cx37, Cx40 und Cx43 Spaltknoten^19,22ausdrücken, ist Cx43 wohl die wichtigste in Bezug auf die Krankheitsprogression²³. Ein Beweis für die Bedeutung von Cx43 kann in der Tatsache gefunden werden, dass die genetische Deletion von Cx43 bei Mäusen zu Hypotonie²⁴ führt und nachteilige Auswirkungen auf die Angiogenese²⁵hat. Darüber hinaus wurde cx43 als wichtig für die Zellmigration und Proliferation und im Fortschreiten der Arteriosklerose^{18,22,23,24,25} .

In diesem Protokoll untersuchten wir mit TFM und MSM, ob Traktion und interzelluläre Spannungserzeugung innerhalb der konfluenten, endotheliaalen Monolayer durch die Störung der endotheliale Spaltkreuzung Cx43 beeinträchtigt würden. Wir störten Cx43 mit 2,5-Dihydroxychalcon (Chalcon), einem Molekül, das dokumentiert ist, um die Cx43-Expression²⁶zu hemmen. Chalcone wurde verwendet, um Cx43 anstelle von siRNA zu stören, da Chalcone zuvor von Lee et al. berichtet wurde, um cx43 Expression²⁶zu stören. Darüber hinaus waren wir besonders an chalcones Einfluss auf das Endothel interessiert, da es auch als entzündungshemmende und thromboplättliche Verbindung berichtet wurde, die potenziell zur Vorbeugung und Behandlung verschiedener Pathologien²⁶. Chalcone-Behandlungen wurden eine Stunde nach Beginn des Experiments durchgeführt, mit Chalcone behandelte Monolayer wurden insgesamt sechs Stunden lang abgebildet, und die Bildverarbeitung wurde mit einem kundenspezifischen MATLAB-Code durchgeführt, um Traktionen und anschließend interzelluläre Betont. Unsere Ergebnisse zeigten eine allgemeine Abnahme der Traktionen und interzellulären Spannungen, was darauf hindeutet, dass Cx43 eine Schlüsselrolle in der endothelialen Biomechanik spielt.