Isolement des sous-ensembles macrophages et des cellules stromales des spécimens myocardiques humains et de souris
Summary
Présenté ici est un protocole pour isoler divers sous-ensembles de macrophages et d’autres cellules non immunisées du myocarde humain et de souris en préparant une suspension de cellules simples par la digestion enzymatique. Des schémas de gating pour l’identification et la caractérisation basées sur la cytométrie de flux sont également présentés.
Abstract
Les macrophages représentent les populations de cellules immunitaires les plus hétérogènes et abondantes dans le cœur et sont au cœur de l’inflammation et des réponses réparatrices après une blessure cardiaque. La façon dont divers sous-ensembles de macrophages orchestrent les réponses immunitaires après une lésion cardiaque est un domaine de recherche actif. Présenté ici est un protocole simple que notre laboratoire effectue régulièrement, pour l’extraction des macrophages à partir de spécimens de myocarde de souris et de myocardes humains obtenus à partir d’individus sains et malades. En bref, ce protocole implique la digestion enzymatique du tissu cardiaque pour générer une suspension de cellules simples, suivie de la coloration d’anticorps, et de la cytométrie de flux. Cette technique convient aux essais fonctionnels effectués sur les cellules triées ainsi qu’au séquençage de l’ARN en vrac et à cellule unique. Un avantage majeur de ce protocole est sa simplicité, la variation minimale au jour le jour et la grande applicabilité permettant l’étude de l’hétérogénéité macrophage à travers divers modèles de souris et entités de maladie humaine.
Introduction
Les macrophages représentent le type de cellules immunitaires le plus abondant dans le cœur, et ils jouent un rôle significatif dans la génération de réponses inflammatoires et réparatrices robustes à la suite d’une blessure cardiaque1,2,3,4. Auparavant, notre groupe a identifié deux sous-ensembles principaux de macrophages dans le coeur murine dérivé des origines développementales distinctes5,6. De façon générale, des populations distinctes de sous-ensembles de macrophage cardiaque résident dans les tissus peuvent être identifiées en fonction de l’expression de surface cellulaire de CCR2 (récepteur c-C motif c. chimiokine 2). CCR2– macrophages (expression de surface cellulaire: CCR2–MHCIIfaible et CCR2–MHCIIélevé) sont d’origine embryonnaire (lignées primitives et érythro-éloïdes), capable de se renouveler, et représentent une population dominante dans des conditions homéostatiques. Les macrophages cCR2résidents sont d’origine hématopoïétique définitive, sont maintenus par le recrutement de monocytes circulants, et représentent une population mineure dans des conditions homéostatiques. Fonctionnellement, CCR2– macrophages génèrent une inflammation minimale et sont critiques pour le développement coronaire régénération cardiaque néonatale5,7. En revanche, les macrophages CCR2initient des réponses inflammatoires robustes à la suite d’insultes cardiaques et contribuent à des lésions cardiomyocytes collatérales, à un remodelage défavorable du ventricule gauche et à une progression de l’insuffisance cardiaque8,9.
Récemment, nous avons montré que le myocarde humain contient également deux sous-ensembles distincts de macrophages identifiés de la même façon que soit CCR2– ou CCR28. L’expression génique et les analyses fonctionnelles ont révélé que les macrophages CCR2– et CCR2– humains représentent des sous-ensembles fonctionnellement divergents et sont fonctionnellement analogues auxmacrophages CCR2et CCR2 – trouvés dans le cœur de souris. CCR2 humain– les macrophages expriment des niveaux robustes de facteurs de croissance, y compris IGF1, PDGF, Cyr61, et HB-EGF. Les macrophages CCR2sont enrichis en chimiokines et cytokines qui favorisent l’inflammation, comme il-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 et TNF-a. Les macrophages stimulés cCR2et sécrétifs sécrètent des niveaux nettement plus élevés de l’interleukine-1 inflammatoire de cytokine -1 (IL-1) dans la culture. La façon dont ces sous-ensembles contribuent différemment à la réparation des tissus et à la remodelage ventriculaire gauche (VL) dans le contexte des lésions cardiaques demeure un domaine de recherche active.
L’analyse basée sur la cytométrie de flux de l’hétérogénéité macrophage dans la souris et le coeur humain exige digérer le tissu cardiaque et produire une suspension de cellules simples suivie d’analyse cytométrique de flux ou de tri de cellules pour d’autres processus en aval tels que le séquençage en vrac d’ARN/séquençage d’ARN de cellules simples ou la culture des cellules pour des essais fonctionnels. Le protocole original pour faire une suspension de cellule simple des coeurs murineont ont été d’abord rapportés par le groupe de Nahrendorf dans Nahrendorf et autres 200710. Notre laboratoire a adapté et modifié le protocole pour extraire les macrophages du myocarde humain. En utilisant le même protocole, mais avec une légère modification dans la coloration et le schéma de gating, CD45– cellules stromales du myocarde humain peut également être récolté. Présenté ici, en texte et en vidéo, est un protocole qui est effectué régulièrement pour l’extraction de macrophages ou stromal à partir du myocarde humain.
Des spécimens de tissu cardiaque sont obtenus des patients adultes présentant la cardiomyopathie dilatée (DCM : idiopathique ou familiale) ou la cardiomyopathie ischémique (ICM) subissant l’implantation gauche d’appareil ventriculaire (LVAD) ou la transplantation cardiaque. Les cœurs explantés ou les noyaux de LVAD sont perfusés intravasculairement avec la saline froide avant de commencer la procédure de digestion. Il est important de noter que la « qualité » des échantillons de tissus déterminés en termes de degré de cicatrisation ou d’infiltration de tissu adipeux peut grandement affecter le rendement des macrophages. Les spécimens de coeur avec de grandes zones de cicatrice scarring auront le rendement beaucoup plus bas de cellules et peuvent poser la limitation technique sérieuse quand les méthodes désirées d’analyse en aval exigent la culture in vitro de cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole permet l’extraction de divers sous-ensembles de macrophages à partir du myocarde humain. Le protocole est simple et prend de 3 à 4 heures pour préparer une suspension à cellule unique prête pour l’analyse FACS. Bien que le protocole soit relativement simple à exécuter, il y a certains aspects techniques qui doivent être considérés qui minimiseront la variabilité. Tout d’abord, travailler en temps opportun avec les tissus humains est nécessaire pour une viabilité cellulaire optimale. Il est impor…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été rendu possible grâce à un financement du Children’s Discovery Institute de l’Université de Washington et de l’Hôpital pour enfants st. Louis (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), de la Fondation de l’Hôpital juif Barnes (8038-88) et de l’NHLBI (R01) HL138466, R01 HL139714). K.J.L. est soutenu par NIH K08 HL123519 et Burroughs Welcome Fund (1014782).
Materials
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petridishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
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