腫瘍抗原特異的T細胞の生成にヒト誘導多能性幹細胞を用いた

1. マウス胚性線維芽細胞(MEF)におけるヒトiPSC(hiPSC)の培養 注:hiPSCを培養するための代替方法は、ゼラチンで事前にコーティングされた6ウェルプレートへの播種、ゼラチンタンパク質混合物、組換えラミニン511、またはhiPSC膨張に使用される他の任意の細胞外マトリックスへの播種を含むがこれらに限定されないが使用できる。ヒト多能性幹細胞培養のために特別に製剤化された定義済み媒体を用いて培養する。 MEFの培養 10cm細胞培養ペトリ皿を4mLの0.1%ゼラチンでコーティングし、37°Cで30分間インキュベートする。 4 x 106照射されたMEFのバイアルを37°MeFメディアの10 mLに素早く解凍する(DMEM + 10% FBS + 1xペニシリン・ストレプトマイシン + 1x L-グルタミンサプリメント)。4 °Cで5分間300 x gで遠心分離機。上清を吸引し、MEF媒体の9mLで細胞ペレットを再中断する。 ゼラチンコーティングされた皿をインキュベーターから取り出します。ゼラチンを吸引し、MEFメディアの7 mLを追加します。メフ懸濁液のプレート3 mL(ステップ1.1.2から)をゼラチンコーティング皿に。皿を左右にロックし、前面から背面にロックして、MEFを皿の上に均等に分配します。8-36時間37°Cでインキュベートする。 MEF の hiPSC の受け渡し注:データは、HLA-A*02:01の文脈で特にマート1ペプチドを認識する長期培養黒色腫TILに由来するMART-1 iPSCを用いて生成された。 コロニーの直径が0.8~1.2mmの場合の通路hiPSC。通過する前に、ステレオ顕微鏡でhiPSCコロニーをチェックし、200°L先端のプラスチックエッジを使用して培養物との差別化の領域を除去します。 吸引使用媒体を使用し、10 mL hiPSC媒体(ヒトES培養媒体[材料表]+10ng/mLヒト塩基性線維芽細胞増殖因子[hbFGF])を10μM ROCK阻害剤で補充した。 セル培養皿を片手に持ち、使い捨てセルパフォージングツールを片方に回します。ローラーブレード全体が培養皿に触れ、圧延中に均一な圧力を維持するように十分な圧力を加えます。 培養皿を90°回転させ、ステップ1.2.3を繰り返します。顕微鏡でプレートを見て、チェッカーで表示されるコロニーの適切な切断を視覚的に確認します。200°Lピペットを使用して穏やかな機械的フラッシュによって切断されたコロニーを取り外します。注:3分後にカットコロニーが皿に再び付着し始め、フラッシングによって均質な大きさのコロニーを剥離することが困難になるため、機械的なフラッシングによるカットコロニーの剥離はローラーでコロニーを切断した直後に行う必要があります。 10μM ROCK阻害剤を補充した新鮮なhiPSCメディアの10 mLで、MEFの新しい10cm皿(hiPSCパッシング前に8-36時間をめっき)にカットコロニーの350-600塊を転送します。37°Cでインキュベートする。注: 600 束は約 1.0 x 106 MART-1 iPSC を表し、35 日目に 0.5 -1.0 x 106 DP セルが生成されます。ただし、期待される数値は、開始細胞株の効力および培養条件によって異なる。 翌日、使用済みメディアを吸引し、新鮮なhiPSCメディアを10mL追加します。hiPSC の成長率に応じて、1 ~ 2 日ごとに hiPSC メディアを変更します。 2. hiPSCとの共培養のためのOP9/DLL1細胞の調製 OP9培地中の培養OP9/DLL1細胞[α-最小必須培地(α-MEM)+20%胎児ウシ血清(FBS)+1xペニシリン・ストレプトマイシン]を37°CでOP9/DLL1細胞が共奏に達すると、吸引媒体を吸引し、1xマグネシウム、カルシウム、およびフェノール赤フリーリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の5mLで1回洗浄する。 PBSを吸引し、0.05%トリプシンEDTAの2 mLを追加します。 37°Cで5分間インキュベートする。次いで、4mLのOP9メディアを加え、ピペットによって細胞層を機械的に解解き、単一細胞懸濁液を作る。 細胞の塊を避けるために、100 μmのセルストレーナーを通して50 mL円錐形チューブに細胞懸濁液を移します。4 °Cで5分間300 x gで遠心分離機。OP9メディアの上清を吸引し、12 mLで再中断。 6つの新しい10 cm細胞培養ペトリ料理のそれぞれに8 mLのOP9メディアを追加します。ステップ2.3から新しい10cm皿にOP9/DLL1細胞懸濁液のプレート2 mL。皿を左右にロックし、その後、皿の上にOP9 /DLL1の均等な分布を確保するために、前面から背面にロックします。 37°Cでインキュベートする。細胞が合流に達すると、2~3日ごとに通過を繰り返します。注:OP9/DLL1細胞の十分な凍結ストックを作成し、4-6週間ごとに新しいストックを解凍することが重要です。 3. CD8αβ+シングルポジティブ(SP)T細胞へのhiPSCのインビトロ分化 hiPSCとの共培養の1週間前にゼラチン化OP9/DLL1料理を準備します。0.1%ゼラチン溶液を調製するには、5mLの室温(RT)組織グレードのストックゼラチン溶液を500mLのPBSに添加します。 コート3新しい10cm細胞培養ペトリ皿は、0.1%ゼラチンの1皿あたり4 mLを加えることによって。 37°Cで30分インキュベートする。 ゼラチンを吸引し、各皿に8 mLのOP9メディアを加えます。OP9/DLL1の1つのコンフルディッシュ(上記のセクション2で行うように)を3つのゼラチン事前コーティングされた料理に通過させます。 4日後、ゼラチンのOP9/DLL1の10cm皿に10mLのOP9メディアを加えて、1皿あたり合計20mLのメディアを加えます。 7 – 8日後に、OP9/DLL1コンフルエント料理(差別化日0)でhiPSC共培養を開始します。 MEF上のhiPSCのコンフルエント10センチ皿からメディアを費やしました。OP9 メディアを 10 mL 追加します。手順 1.2.3 および 1.2.4 で行った使い捨てセルパフォージング ツールを使用して、hiPSC コロニーをカットしてデタッチします。 200 μL ピペットを使用して、10 cm のゼラチン化済み OP9/DLL1 皿 (ステップ 3.1) に切断されたコロニーの 350 ~ 600 束を転送します。培養皿を左右にロックし、その後、コロニーの均等な分布を確保するために、フロントツーバック。注:あるいは、あらかじめ形成されたhiPSC胚体(EB)または小さな束懸濁液が使用され得る。 しかしながら、使い捨てセルパソエーションツールまたはEB形成システムの使用は、均一なサイズのhiPSC塊を生成することが好ましい。 1日目に、吸引は使用されたメディアを吸引し、新鮮なOP9メディアの20 mLに置き換えます。OP9/DLL1 で 1 日間共培養された hiPSC 塊は、小さな丸い単層コロニーとして表示されます (図 1)。 5日目に、10 mLの使用済みメディアを吸引し、新鮮なOP9メディアを10mL追加します。hiPSCコロニーは、多層暗い中心によって特徴付けられた原始的な中皮に分化し始めます。 9日目に、10 mLの使用済みメディアを吸引し、新鮮なOP9メディアを10mL追加します。この時点で、多層中心構造はドーム状の形状に進化し、周辺ネットワークのような領域が明らかになり始めます。 13日目に造血前駆細胞(HpC)を収穫する(図1)。13日目のhiPSC由来の構造は、ドーム状領域のネットワークに囲まれた暗い中央オルガノイドによって特徴付けられ、造血帯(HZs)を代表して、ヒト胚性幹細胞由来造血前駆体を囲むよう以前に報告された21.注:ドーム状の構造の存在は、暗い中心がない場合でも、成功したプロセスを示しています。HPCの生産不能は、OP9/DLL1の品質の低下、FBSロットの品質、OP9/DLL1に播種されたiPSC塊のコンフルエンシー(350-600塊が最適)、および/または造血前駆体を生成するiPSCラインの効力の変動が原因である可能性があります。 吸引は、カルシウムとマグネシウム(HBSS)で修飾された1xフェノール赤フリーハンクスのバランスのとれた塩溶液の5 mLで使用されたメディアと洗浄1x。 HBSSを吸引し、HBSSの10 mLに5000単位/mLコラゲラーゼIVの250 μLを加えます。コラゲラーゼIVで37°Cでインキュベートし、5mLのPBSで1回洗浄します。 PBSを吸引し、0.25%トリプシンEDTAの5 mLを追加します。37°Cで20分間インキュベートします。次いで、4mLのOP9メディアを加え、ピペットによって細胞層の解ソを解除し、単一細胞懸濁液を作る。 100μmのセルストレーナーを介して50 mL円錐管に細胞懸濁液を移します。 4 °Cで5分間300 x gで遠心分離機。OP9メディアの上清を吸引し、10mLで再中断する。 新しいゼラチン化10cm細胞培養ペトリ皿にプレートセル懸濁液(ステップ3.1.1および3.1.2を参照)。37°Cで45分間インキュベートします。次いで、穏やかなピペットによって非付着細胞を収集する。 収集した細胞懸濁液を100μmの細胞ストレーナーを介して50mL円錐管に移す。 4 °Cで5分間300 x gで遠心分離機。分化媒体の10mLで上清を吸引し、再サスペンド[OP9メディアは5ng/mLヒト幹細胞因子(hSCF)、5 ng/mLヒトFlt3リガンド(hFLT3L)、および5 ng/mLヒトインターロイキン7(hIL-7)]。 セルサスペンションを新しい10cm OP9/DLL1コンフルディッシュにプレートします。 16日目に細胞を通す。 穏やかなピペットによって非付着細胞を機械的に取り外し、100μmの細胞ストレーナーを通してろ過する。4 °Cで5分間300 x gで遠心分離機。上清を吸引し、10 mLの分化媒体で再中断する。 セルサスペンションを新しい10cm OP9/DLL1コンフルディッシュにプレートします。 ステップ3.8を繰り返して、その後5〜7日ごとに非付着細胞の受け渡しを続ける。 35日目に、CD4+CD8+ダブル陽性(DP)集団を濃縮し、刺激してCD8αβ+SP T細胞を産生する(図2)。 穏やかなピペットによって非付着細胞を機械的に取り外し、100μmの細胞ストレーナーを通して濾過し、細胞塊を除去します。メーカーのプロトコルに従ってCD4磁気ビーズ分離によってCD4+細胞集団を豊かにします。注:CD4磁気ビーズを使用する根拠は、CD4−CD8−DN細胞を培養物から除去することにあるが、これらは刺激22後にCD4+CD8+DP細胞の直接殺傷を引き起こすことが実証されている。 ノイバウアー血球計とトリパンブルー色素を使用して、生きたCD4濃縮細胞を数えます。 総濃度0.5 x 106セル/mLでOP9メディアにサスペンド。細胞懸濁液のアリコート1mL(0.5×106細胞)をコンフルエントOP9/DLL1の組織培養平底24ウェルプレートの各ウェルに。 100 IUヒトインターロイキン2(hIL-2)、5 ng/mL hIL-7、500 ng/mL抗ヒトCD3抗体、および2μg/mL抗ヒトCD28抗体を加え、37°Cで培養する。 刺激後4日目から7日目に、分子分析用の細胞を採取(図3)、またはペプチドパルス抗原提示細胞(APC)と共培養する。 4. hiPSC由来CD8αβ+SP T細胞の抗原特異性の測定 注:このエクスペリメントに使用される APC のタイプは、hiPSC 派生 T セルの MHC 制限に依存します。ここで、T2細胞株が用いられ、これはTおよびBリンパ芽球細胞株のハイブリッドである。T2細胞はHLA-A*02:0123を発現し、これはMART1-iPSCが由来したJKF6細胞によって認識される18である。このT2細胞株はRPMI 1640 + 20% FBS + 1xペニシリン・ストレプトマイシンで拡張することができ、細胞が5 x 105細胞/mLの密度に達すると通過する。 生きたHLA-A*02:01+ T-Bハイブリッドリンパ芽球T2細胞をノイバウアー血球計とトリパンブルー色素を使用してカウントします。24ウェル組織培養プレートに1μg/mL MART-1ペプチドを含むAPCを37°Cで2時間インキュベートします。注:最適なペプチド濃度は、細胞株および抗原特異性に応じて可変である。 APCを収集し、余分なペプチドを除去するためにPBSの10 mLで2xを洗浄します。 100 IU IL-2 および 5 ng/mL IL-7 を使用して、OP9 メディアで APC をカウントし、2 x 5 x 105セル/mL で中断します。アリコート100μLの細胞懸濁液(2-5 x 104細胞)を超低着取り付けU底96ウェルプレートの各ウェルに、または事前にコーティングされたELISpotプレートに直接入れます。 細胞選別器を用いてhiPSC由来CD8αβ+SP T細胞(抗ヒトCD3/CD28抗体刺激の1週間後)を並べ替え、100 IU IL-2および5 ng/mL IL-7でOP9媒体で1 x 106細胞/mLで中断する。アリコート100μLの細胞懸濁液(1×105細胞)を各ウェルにAPC及び培養を37°Cで16〜20時間培養する。 16~20時間後、製造業者のプロトコルに従ってELISpotアッセイによるサイトカイン分泌プロファイルを分析する(図4)。