利用人类诱导多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞

1. 在小鼠胚胎纤维细胞（MEF）上培养人类iPSC（hiPSC） 注：也可以使用培养 hiPSC 的替代方法，包括但不限于：在 6 孔板上播种，预涂有明胶、胶状蛋白混合物、重组层蛋白 511，或用于 hiPSC 扩展的任何其他细胞外基质，以及使用专为人类多能干细胞培养而配制的定明介质培养。 栽培 MEF 涂上4 mL 0.1%明胶的10厘米细胞培养培养培养皿，在37°C下孵育30分钟。 将一小瓶4 x 106辐照MEF快速解冻至10 mL的37°C MEF介质（DMEM = 10% FBS = 1x青霉素-链霉素 = 1x L-谷氨酰胺补充剂）。在 300 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。吸出上清液，在MEF介质的9 mL中重新悬浮细胞颗粒。 从培养箱中取出明胶涂层的盘子。吸气明胶，并添加7 mL的MEF介质。将 MEF 悬架的 3 mL 板（从步骤 1.1.2）板到明胶涂层盘上。从侧面和前后摇动菜，确保 MEF 在盘子上均匀分布。在37°C孵育8-36小时。 在 MEF 上传递 hiPSC注：数据是使用从长期培养的黑色素瘤TIL中提取的MART-1 iPSC生成的，该类型在HLA-A_02：01上下文中专门识别MART-1肽，如前所述18。 当菌落直径在 0.8 – 1.2 mm 之间时，通过 hiPSC。在通过之前，在立体显微镜中检查hiPSC菌落，并使用200 μL尖端的塑料边缘去除培养体的任何分化区域。 吸气废介质，并添加10 mL hiPSC介质（人类ES培养基 [材料表]= 10纳克/mL 人类基本成纤维细胞生长因子[hbFGF]）辅以10μM ROCK抑制剂。 一手握住细胞培养皿，将一次性细胞传递工具卷过整个盘子，朝一个方向。施加足够的压力，使整个滚轮叶片接触培养皿，并在滚动操作过程中保持均匀的压力。 旋转培养皿 90°并重复步骤 1.2.3。在显微镜中查看板，以目视确认对菌落的正确切割，这些菌落应呈方格。使用 200 μL 移液器通过温和的机械冲洗分离切割菌落。注：用滚筒切割菌落后，必须立即通过机械冲洗分离切割菌落，因为 3 分钟后，切割菌落将开始重新连接到盘子，并且很难通过冲洗分离同质大小的菌落。 将 350 – 600 团切割菌落转移到新的 10 厘米的 MEF 盘中（在 hiPSC 传化前 8 – 36 小时）与 10 mL 的新鲜 hiPSC 介质辅以 10 μM ROCK 抑制剂。在37°C孵育。注：600团表示约1.0 x 106 MART-1 iPSC，将在第35天产生0.5-1.0 x 106 DP细胞。但是，预期数量将因起始细胞系的效力和培养条件而异。 第二天，吸气废介质并添加 10 mL 的新鲜 hiPSC 介质。根据 hiPSC 增长率，每 1-2 天更换一次 hiPSC 介质。 2. 制备OP9/DLL1细胞，用于与hiPSC共培养 OP9培养基中[最小必需介质（β-MEM）+20%胎儿牛血清（FBS）+1x青霉素-链霉素]中的培养蛋白在37°C下。当OP9/DLL1细胞达到汇合时，吸气培养基用5mL的1x镁、钙和无苯酚无红磷酸盐缓冲盐水（PBS）。洗涤一次。 吸气PBS，并添加2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA。 在37°C下孵育5分钟。然后，加入4 mL的OP9介质，通过移液机械分离细胞层，使单细胞悬浮。 通过100μm细胞过滤器将细胞悬浮液转移到50 mL锥形管中，以避免细胞团块。在 300 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。吸出上清液，并在 OP9 介质的 12 mL 中重新悬浮。 在 6 个新的 10 厘米细胞培养培养皿中，每增加 8 mL 的 OP9 介质。从步骤 2.3 到每个新的 10 厘米盘的 OP9/DLL1 细胞悬浮液的板 2 mL。从正面到背面摇动菜，以确保 OP9/DLL1 在盘上均匀分布。 在37°C孵育。当细胞到达汇合时，每2-3天重复一次。注：制作足够的OP9/DLL1细胞冷冻库存，每4-6周解冻一次新股票，这一点很重要。 3. 在体外分化高PSC到CD8+++单正（SP）T细胞 在与 hiPSC 共同培养前一周准备明胶化 OP9/DLL1 菜肴。要制备0.1%明胶溶液，将5mL室温（RT）组织级库存明胶溶液加入500 mL的PBS中。 涂层 3 新的 10 厘米细胞培养培养培养皿，每道菜加入 4 mL 0.1% 明胶。 在37°C下孵育30分钟。 吸气明胶，并在每道菜中加入8 mL的OP9介质。将 OP9/DLL1 的一个汇盘中（如上文第 2 节所示）移至三道明胶预涂盘。 4天后，在明胶上每 10 厘米的 OP9/DLL1 盘中添加 10 mL 的 OP9 介质，每道菜共 20 mL 的介质。 7 – 8天后，开始对OP9/DLL1汇盘（分化日0）进行hiPSC共培养。 吸气花费媒体从融合 10 厘米盘的 hiPSC 在 MEF.添加 10 mL 的 OP9 介质。使用一次性细胞通过工具切割和分离 hiPSC 菌落，如步骤 1.2.3 和 1.2.4 中所做的那样。 使用 200 μL 移液器将 350 – 600 团切割菌落转移到 10 厘米预明胶化 OP9/DLL1 盘（步骤 3.1）上，使用 10 mL 的新鲜 OP9 介质。从正面到背面摇动文化菜，以确保菌落的均匀分布。注： 或者，可以使用预成型的 hiPSC 胚胎体 （IB） 或小团块悬浮液。 然而，使用一次性细胞传递工具或EB形成系统是首选产生统一大小的hiPSC团块。 在第 1 天，吸气废旧介质，并替换为 20 mL 的新鲜 OP9 介质。在OP9/DLL1上共同培养1天的hiPSC团群将显示为小圆单层菌落（图1）。 第 5 天，吸出 10 mL 的废介质，并添加 10 mL 的新鲜 OP9 介质。hiPSC菌落将开始分化成原始中皮，其特点是多层黑暗中心。 第 9 天，吸出 10 mL 的废介质，并添加 10 mL 的新鲜 OP9 介质。此时，多层中心结构将演化为圆顶状形状，外围网络状区域将开始变得明显。 第13天，收获造血祖细胞（HPCs）（图1）。第13天HiPSC衍生结构的特点是一个黑暗的中央器官，周围是圆顶状区域网络，代表先前报告包围人类胚胎干细胞衍生造血祖体的造血区（HZs）21.注：在没有暗中心的情况下，圆顶状结构的存在表明过程是成功的。无法生产 HPC 可能是由于 OP9/DLL1 质量差、FBS 批次质量低、种子到 OP9/DLL1 上的 iPSC 团块的汇合（350-600 团群是最佳），以及/或 iPSC 管路效力的变化以产生造血前体。 吸气废介质和洗涤1x与5mL的1x苯酚无红汉克斯的平衡盐溶液与钙和镁（HBSS）修饰。 吸气HBSS，在10 mL的HBSS中加入250μL的5000单位/mL胶原酶IV。在37°C孵育45分钟。用胶原酶IV吸脂HBSS，用5mL的PBS洗涤一次。 吸气PBS，并加入5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA。在37°C孵育20分钟。然后，加入4 mL的OP9介质，通过移液分离细胞层，使单细胞悬浮。 通过100μm细胞过滤器将细胞悬浮液转移到50 mL锥形管中。 在 300 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。吸出上清液，并在 OP9 介质的 10 mL 中重新悬浮。 板细胞悬浮到新的明胶10厘米细胞培养培养皿（见步骤3.1.1和3.1.2）。在37°C孵育45分钟。然后，通过温和的移液收集非粘附细胞。 通过100μm细胞过滤器将收集的细胞悬浮液转移到50mL锥形管中。 在 300 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。在10 mL的分化介质中吸出上清液并重新悬浮[OP9介质，具有5纳克/mL人类干细胞因子（hSCF）、5纳克/mL人FLT3配体（hFLT3L）和5纳克/mL人类白细胞介素7（hIL-7）]。 将细胞悬架盘到新的 10 厘米 OP9/DLL1 汇盘中。 第16天，通过细胞。 通过温和的移液和过滤100μm细胞过滤器，机械地分离非粘附细胞。在 300 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。吸出上清液，并在10 mL分化介质中重新悬浮。 将细胞悬架盘到新的 10 厘米 OP9/DLL1 汇盘中。 之后每5-7天通过重复步骤3.8继续传递非粘附细胞。 在第35天，丰富CD4+CD8+双阳性（DP）总体，刺激产生CD8+++SP T细胞（图2）。 通过温和的移液和过滤100μm细胞过滤器，机械地分离非粘附细胞，以去除细胞团块。根据制造商的协议，通过CD4磁珠隔离来丰富CD4+细胞群。注：使用CD4磁珠的原理是从培养基中去除CD4-CD8-DN细胞，因为已经证明这些细胞在刺激后会导致CD4+CD8+DP细胞的直接杀伤。 使用 Neubauer 血细胞计和 Trypan 蓝色染料计数活 CD4 富集细胞。 以总浓度 0.5 x 106细胞/mL 悬浮在 OP9 介质中。将1 mL的细胞悬浮液（0.5 x 106细胞）放入每个孔的组织培养平底24孔板的汇合OP9/DLL1。 加入100 IU人白莱素2（hIL-2），5纳克/mL hIL-7，500纳克/mL抗人CD3抗体，2μg/mL抗人CD28抗体，然后在37°C培养。 在刺激后第4-7天，收集细胞进行分子分析（图3）或与肽脉冲抗原呈现细胞（APC）共培养。 4. 测量hiPSC衍生CD8+++SP T细胞的抗原特异性 注：用于此测试的 APC 类型取决于 hiPSC 衍生 T 细胞的 MHC 限制。在这里，使用T2细胞系，这是T和B淋巴细胞系的杂交。T2细胞表达HLA-A_02：0123，这是由JKF6细胞识别，其中MART1-iPSC派生18。此 T2 细胞系可在 RPMI 1640 + 20% FBS + 1x 青霉素-链霉素中扩展，当细胞密度达到 5 x 105细胞/mL 时，可通过。 使用 Neubauer 血细胞测定仪和锥形蓝色染料计数实时 HLA-A_02：01= T-B 混合淋巴细胞 T2 细胞。在24孔组织培养板中孵育APC，在37°C下用1μg/mL MART-1肽孵育2小时。注：最佳肽浓度是可变的，取决于细胞系和抗原特异性。 收集APC，用10 mL的PBS洗涤2倍，以去除任何额外的肽。 在 OP9 介质中计数 APC 并悬浮在 2 × 5 x 105个单元/mL，介质中具有 100 IU IL-2 和 5 纳克/mL IL-7。将100 μL的细胞悬浮液（2-5 x 104细胞）放入超低附件U底部96孔板的每个孔中，或直接放入预涂的ELISpot板中。 使用细胞分拣机对HIPSC衍生的CD8++++SP T细胞（抗人CD3/CD28抗体刺激后1周）进行分类，并在100 IU IL-2和5 ng/mL IL-7的OP9介质中悬浮在1 x 106细胞/mL。将100μL的细胞悬浮液（1 x 105细胞）到APC的每口井中，在37°C下培养16-20小时。 16-20小时后，根据制造商的协议（图4）通过ELISpot测定分析细胞因子分泌配置文件。