JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie du développement

Een directe en eenvoudige methode om de levensvatbaarheid van Drosophila melanogasterte beoordelen van embryo tot volwassene

Published: August 27, 2019
doi:
10.3791/59996
, ,
1Department of Biology,Clarkson University

Summary

Dit protocol is ontworpen om de levensvatbaarheid van Drosophila in elke ontwikkelingsfase, van embryo tot volwassene, te beoordelen. De methode kan worden gebruikt om de levensvatbaarheid van verschillende genotypen of groeiomstandigheden te bepalen en te vergelijken.

Abstract

In Drosophila melanogaster, levensvatbaarheid testen worden gebruikt om te bepalen van de geschiktheid van bepaalde genetische achtergronden. Allelische variaties kunnen resulteren in gedeeltelijk of volledig verlies van levensvatbaarheid in verschillende ontwikkelingsstadia. Ons lab heeft een methode ontwikkeld om de levensvatbaarheid in Drosophila te beoordelen van embryo tot volledig volwassen volwassene. De methode is gebaseerd op het kwantificeren van het aantal nakomelingen dat aanwezig is in verschillende stadia tijdens de ontwikkeling, te beginnen met uitgekomen embryo’s. Nadat de embryo’s zijn gekwantificeerd, worden er extra stadia geteld, waaronder L1/L2, pupae en Mature Adults. Nadat alle stadia zijn onderzocht, wordt een statistische analyse zoals de Chi-Square test gebruikt om te bepalen of er een significant verschil is tussen het beginaantal nakomelingen (uitgekomen embryo’s) en latere stadia die culmineren in het waargenomen aantal volwassenen, het afwijzen of aanvaarden van de nulhypothese (dat het aantal uitgekomen embryo’s gelijk is aan het aantal larven, poppen en volwassenen dat in de ontwikkelingsstadia wordt opgetekend). Het belangrijkste voordeel van deze test is de eenvoud en nauwkeurigheid, omdat het niet nodig is om een embryo te spoelen om ze over te brengen naar de injectieflacon met voedsel, waardoor verlies van technische fouten wordt vermeden. Hoewel het hier beschreven protocol niet direct onderzoekt L2/L3 larven, extra stappen kunnen worden toegevoegd aan de rekening voor deze. Het vergelijken van het aantal uitgekomen embryo’s, L1, pupae en volwassenen kan helpen bepalen of de levensvatbaarheid is aangetast tijdens de L2/L3-stadia voor verdere studies (het gebruik van gekleurd voedsel helpt bij de visuele identificatie van larven). Over het algemeen, deze methode kan helpen Drosophila onderzoekers en opvoeders bepalen wanneer levensvatbaarheid wordt aangetast tijdens de vlucht levenscyclus. Routine matige beoordeling van de voorraden met deze test kan ophoping van secundaire mutaties voorkomen die het fenotype van de oorspronkelijk geïsoleerde Mutant kunnen beïnvloeden, vooral als de oorspronkelijke mutaties de geschiktheid beïnvloeden. Om deze reden, ons lab onderhoudt meerdere exemplaren van elk van onze DM ime4 allelen en routinematig controleert de zuiverheid van elke kolf met deze methode naast andere moleculaire analyses.

Introduction

De levensduur wordt beïnvloed door genetische en niet-genetische factoren. In standaard labgroeiomstandigheden bij kamertemperatuur heeft ons lab significante variatie van geschiktheid en levensvatbaarheid waargenomen tussen verschillende DM ime4 -allelen die onder identieke omstandigheden zijn geteeld (Figuur 1 en aanvullende cijfers). Levensvatbaarheid studies worden vaak gedaan om te onderzoeken van de effecten van een bepaalde allel combinatie of groei conditie in populatie genetische studies1,2,3,4. Gedetailleerde analyses van de levensvatbaarheid binnen een niet-complementaire groep van mutaties zijn echter moeilijk te vinden in de wetenschappelijke literatuur. Een allel is meestal gelabeld als “niet-essentieel” als de onderzoeker een paar individuen homozygoot voor dat allel vindt in de flacon met levensmiddelen die de evenwichtige voorraad5,6herbergt. Echter, nauwkeurige Chi-Square analyses om te beoordelen of deze homo zygoten ontstaan bij de verwachte Mendeliaanse verhoudingen worden niet gemeld5,6. De meest permissieve temperatuur voor elke Drosophila kolf is kamertemperatuur (22-23 °c) en, met gepaste voedingsstoffen, duurt de levenscyclus van vliegen van wild type ongeveer twaalf dagen om7,8te voltooien. Aangezien de duur van elke ontwikkelingsfase van wild-type Drosophila 7,8bekend is, kan de methode die in dit rapport wordt beschreven, worden gebruikt om te onderzoeken of de stam Drosophila in de studie geschikt is voor elke fase in vergelijking met een controle die geschikt is voor de geteste genetische achtergrond. In tegenstelling tot studies die gericht zijn op een specifiek aspect van ontwikkeling9, biedt dit protocol een praktische manier om de levensvatbaarheid in verschillende ontwikkelingsstadia te beoordelen.

In ons lab wordt dit protocol gebruikt om de levensvatbaarheid te beoordelen van bestanden die een tekort hebben aan Drosophila inductor van meiosis 4 (DM ime4). DM ime4 is een essentieel gen10 dat codeert voor een RNA-methyltransferase met kritische rollen in RNA metabolisme in Drosophila en andere multicellulaire organismen5,6,10, 11 , 12 , 13 , 14 . Om snel te evalueren nieuwe allelen van DM ime4 gegenereerd via crispr/Cas9 (aanvullende cijfers), een eindpunt levensvatbaarheid assay werd uitgevoerd dat alleen geteld volwassen nakomelingen geproduceerd binnen flesjes van evenwichtige voorraden (Figuur 1). Sommige van de gebruikte voorraden werden beschreven in eerdere DM ime4 rapporten5,6. Homozygoot mutanten ontstonden op sub-Mendeliaanse niveaus, zoals bepaald door Chi-Square analyses (Figuur 1 en aanvullende materialen). Om te beoordelen of deze lager dan verwachte aantallen te wijten waren aan minder embryo’s, of minder uitgekomen embryo’s, of verlies van levensvatbaarheid in L1/L2 of pupae, hebben we de tracking uitgebreid met tellingen bij elk van deze ontwikkelingsstadia (Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4, Figuur 5, Figuur 6, Figuur 7, Figuur 8en Figuur 9).

Hier beschrijven we de methode met behulp van wild-type (OreR) vliegen. Om deze methode empirisch te testen voor gebruik met andere genetische achtergronden of Drosophila soorten, raden we aan OreR als referentie te gebruiken en tijdpunten aan te passen volgens het experimentele organisme.  Het protocol werd verder geëvalueerd om de levensvatbaarheid van nakomelingen te beoordelen die werden gegenereerd door het kruisen van maagdelijke wilde vrouwtjes met mannetjes uit een heterozygoot DM ime4 Mutant Stock5,6 (Figuur 4).

Protocol

1. Media voorbereiding Bereid de druif agar volgens de instructies van de fabrikant (Zie tabel van de materialen) en giet in een 35 mm Petri schaal tot half-vol (Figuur 5).  Laat gedurende ongeveer 1 uur stollen. Nadat de druif agar stolt, onmiddellijk gebruiken of bewaren bij 4 °C. Maak voorzichtig krassen over de agar plaat met een klein plastic mes (vliegen om op ongelijke ondergronden te leggen) en laat het midden van de plaat zonder krassenachter (figuur 5). Plaats een kleine hoeveelheid gist pasta (vers gemaakt; Zie tabel met materialen) in het midden van de plaat (Figuur 5). 2. embryo collectie mini kooi instellen Stel een kruis in met twee maagdelijke vrouwtjes en een jong mannetje in de embryo-opvang kooi met de Grape agar-plaat aangevuld met gist pasta (Figuur 5). Inspecteer na 24 uur de kooien voor de gelegde embryo’s zonder de kooi te openen door te kijken naar de bodem van de agar-plaat.  Als er embryo’s zijn gelegd, verwijder de agar-plaat van de kamer en plaats deze in een vochtige kamer voor microscopische observatie (Figuur 6).  Als meerdere dagen van leggen worden gescoord (bijvoorbeeld vruchtbaarheid/levensduur testen), houd de fok ouders en vervang de plaat met een vers bereid zoals beschreven. Vroege collecties van minder dan 24 h kan worden gedaan, maar bij het gebruik van maagdelijke vrouwtjes, zich ervan bewust dat ze niet zal leggen tot 48 h na het ontstaan uit hun PUPA geval. Bedek de agar-plaat die embryo’s bevat met het Petri schaaldeksel om uitdroging te voorkomen en plaats deze onmiddellijk in een vochtige kamer (Figuur 7). Observeer onder een ontleed Microscoop en noteer gearceerde embryo’s en L1.  Vervang het deksel en bewaar op kamertemperatuur in een vochtige kamer totdat alle embryo’s zijn uitgebroed en zijn ontwikkeld tot L1 larven (Figuur 6). 3. tellen van embryo’s en larven Na 48 h, observeer de platen onder de ontsnij Microscoop en noteer de cijfers een laatste keer vóór de overdracht van de agar-schijf naar de injectieflacon met voedsel.  Bevruchte/levensvatbare embryo’s moeten dan L1 worden.  Langere incubatie perioden voorafgaand aan de overdracht zijn mogelijk, maar houd er rekening mee dat de platen kunnen beginnen met het verliezen van vocht en dat de agar een schone overdracht aan voedsel flesjes in gevaar kan brengen (Figuur 7).  Om ervoor te zorgen dat de platen gehydrateerd blijven en de levensvatbaarheid van embryo’s niet in het gedrang komt tijdens het tellen, vermijd je het gebruik van een direct zwanenhals-licht over het agar-oppervlak (Figuur 7E toont een geschikte afstand). Na het tellen, dek de plaat en bewaar deze in de vochtige kamer tot het klaar is om over te dragen. Noteer de bevindingen. 4. Breng de druif agar-schijf over in een voedsel flacon om de levensvatbaarheid tijdens de ontwikkeling te bewaken Zodra de getallen zijn geregistreerd (uitgekomen embryo’s/L1/L2), gebruikt u een spatel om de druif agar-schijf voorzichtig over te brengen naar een injectieflacon die groot genoeg is voor een schijf van 35 mm met Drosophila-voedingsmiddelen, bereid volgens de instructies van de fabrikant (Zie de lijst van reagentia). Plaats de Grape agar disc L1-side Down op het voedsel (Figuur 7).  Na het overzetten van de agar-schijf met larven naar de voedsel flacon, Inspecteer je de lege Petri schaal zorgvuldig op eventuele larven die achterblijven (Figuur 7E). Instellen van een schema voor het inspecteren van voedsel flesjes dagelijks, op ongeveer hetzelfde tijdstip elke dag, om ervoor te zorgen L2/L3 larven worden waargenomen maken hun weg naar het voedsel in de flacon (Figuur 8). Noteer het aantal poppen en volwassen Drosophila (Figuur 9). Blijf tellen totdat er niet meer volwassenen worden waargenomen en Vermijd het tellen van de volgende generatie (tellen niet meer dan 9 dagen na het observeren van de eerste volwassenen). Observeer de bevindingen en noteer deze. Pas het tijdsbestek van het verzamelen, tellen en opnemen van embryo’s dienovereenkomstig aan de Mutante kolf die wordt gebruikt. Voer een Chi Square-analyse uit. De nulhypothese veronderstelt 100% levensvatbaarheid, zodat het aantal volwassenen gelijk is aan het aantal uitgekomen embryo’s en L1 dat oorspronkelijk is geregistreerd en overgebracht naar de voedsel flesjes

Representative Results

Deze methode geeft nauwkeurig en reproductief de mogelijkheid om de levensvatbaarheid van embryo’s te meten om volwassenen te kunnen ontstaan wanneer ze gekoppeld zijn aan Chi Square analyses. In eerste studies, na het tellen van embryo’s en larven, werd de druif agar in de flacon rechtop aan de zijkant van de injectieflacon geplaatst. Helaas, toen de agar aan de zijkant van de flacon werd geplaatst, waren veel van de embryo’s en larven niet volwassen voor volwassenen. Dit was waarschijnlijk te wijten aan het uitdrogen van de Grape agar disc (Figuur 3). Deze plaatsing introduceerde een omgevingsvariabele (hydratatie van agar-schijf) die de resultaten kon Verdoe- Ongeveer 39% van de nakomelingen is verloren gegaan tussen embryo’s aan volwassen, omdat slechts 61% van de volwassenen ontstond. De grootste verliezen traden op tussen de L1 larven (geteld op het oppervlak van Grape agar platen) en poppen (geteld op wanden van voedsel flesjes) tellingen. Wanneer de druif agar echter in direct contact met het voedsel oppervlak in de injectieflacon werd geplaatst, werd minder dan 6% van de nakomelingen verloren (Figuur 2). De agar bleef gehydrateerd omdat de gehele Grape agar schijf in contact bleef met het vocht van het oplosmiddel in de injectieflacon (Figuur 7, Figuur 8). Deze resultaten geven aan dat de positie van de agar in de injectieflacon belangrijk is voor het verkrijgen van betrouwbare gegevens en het minimaliseren van de bijdrage van omgevingsvariabelen. Verdere gegevens ter ondersteuning van de effectiviteit van de methode werden verzameld door het vergelijken van wild-type nageslacht gebruikt in de initiële methode validatie en nakomelingen geproduceerd door kruising Virgin wild-type vrouwtjes naar mannetjes uit een evenwichtige DM ime4 Mutant voorraad ( Aanvullende figuur 2, IME4ΔNULL/TM3SB). Ongeveer 91% van de nakomelingen gerijpt tot volwassenheid ten opzichte van 94% van de nakomelingen van wild type (Figuur 4).  Dit verschil was niet statistisch significant. Homozygoot DM ime4 Mutant mannetjes5 werden ook gebruikt om de methode verder te valideren. De homozygoot mutanten waren echter te ziek om te reproduceren en stierf voordat embryo’s werden afgezet. Daarom is een beperking van het experiment dat mannetjes gezond genoeg moeten zijn om zich te reproduceren om een beginnende embryo populatie te genereren om te volgen. Figuur 1 : DM ime4 Mutant aandelen verschijnen op sub-Mendeliaanse niveaus. Voorraden waarin gedeelten van het katalytische domein of het ADO-met-bindende domein zijn gemuleerd, worden weergegeven (Zie aanvullende figuur 1 voor meer informatie). Sommige aandelen hadden gedeelten van beide domeinen die werden vervangen door Ala (alanine-Scanning mutagenese), terwijl andere voorraden een of beide domeinnamen hadden verwijderd. De verhouding tussen het waargenomen aantal homo zygoten en de verwachte aantallen wordt weergegeven in percentages (in vergelijking met heterozygoot-eenheden van hetzelfde niveau, Zie aanvullende figuur 3 voor sorteer schema en Chi-vierkante analyse). Chi Square analyses werden uitgevoerd om te bepalen of het verschil tussen waargenomen en verwacht statistisch significant was en niet te wijten aan toeval alleen (p-waarden < 0,01). Foutbalken vertegenwoordigen standaardfout van het gemiddelde (minimum van drie proeven per Kruis aangegeven).  Een spreadsheet met alle gegevens kan worden gevonden in aanvullende materialen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2 : Agar-positie in de injectieflacon kan onbedoelde omgevingsvariabelen introduceren. Histogram van het aantal individuen in verschillende stadia van ontwikkeling geteld van Grape agar schijf embryo zijde naar beneden in de voeding flacon of agar aan de zijkant van de voedsel flacon. Het in de injectieflacon plaatsen van de agar-schijf met embryo-zijde resulteerde in 94% (SD ± 0,02) van de oorspronkelijke embryo’s die tot de volwassenheid overleven. Het plaatsen van de agar aan de zijkant van de injectieflacon met voedsel resulteerde in slechts 61% (SD ± 0,07) van de oorspronkelijk getelde embryo’s die volwassen werden. Een spreadsheet met alle gegevens kan worden gevonden in de aanvullende materialen. De verwachte aantallen in elke fase worden ingesteld als het aanvankelijke aantal embryo’s/L1 dat is geteld op de druif agar-schijf voorafgaand aan de injectieflacon met levensmiddelen (nulhypothese: 100% van de uitgekomen embryo’s ontwikkelt). De waargenomen getallen zijn het werkelijke aantal personen dat is geteld voor de aangegeven ontwikkelingsfase. Elke fase wordt dus vergeleken met het aanvankelijke aantal uitgekomen embryo’s dat op de druivenagar plaat wordt geteld. Chi Square analyses werden uitgevoerd om te bepalen of het verschil tussen waargenomen en verwacht statistisch significant was en niet te wijten aan toeval alleen met behulp van een p-waarde drempel van 0,05. Het verschil was significant voor embryo’s geteeld met agar aan de zijkant van de voedsel flacon, maar niet voor degenen die zijn geteeld in een schijf embryo zijde naar beneden. Fouten balken vertegenwoordigen standaardfout (minimaal drie proeven per Kruis aangegeven). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3 : Cartoon met twee manieren waarop druiven agar-schijven met embryo’s/L1s in de voedsel flacon kunnen worden geplaatst. Er was een significant verschil tussen het totale aantal embryo’s en volwassen nakomelingen op basis van de positie van de agar in de voedsel flacon. Het verschil vloeit voort uit een omgevingsvariabele (hydratatie) die wordt gecreëerd door het verschil in de plaatsing van de schijf in de flacon met voedsel: er is een statistisch significant verschil tussen de verwachte en waargenomen getallen in de larven en de poppen telt wanneer de agar de schijf werd aan de zijkant van de injectieflacon geplaatst versus geen significant verschil in de verwachte versus waargenomen getallen wanneer de agar-schijf in contact was met het voedsel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4 : Histogram met het aantal individuen in verschillende ontwikkelingsstadia van wild-type mannetjes versus mannetjes uit een DM ime4 Mutant gebalanceerde kolf. Evenwichtige mannetjes kruisten naar maagdelijke wilde-type vrouwtjes zoals beschreven in 2,1.  Agar werd aan embryo zijde naar beneden overgebracht in voedsel flesjes.  De gemiddelde ratio van volwassenen uit de oorspronkelijke embryo’s geteld in Grape agar schijven van wild-type X wild-type was 94%, SD ± 0,02, terwijl die ratio voor DM ime4 Mutant/+ X wild-type was 91%, sd ± 0,01. Statistische analyse werd uitgevoerd zoals beschreven voor Figuur 2; verschillen waren voor beide groepen niet significant. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 5 : Experimentele Setup. A) embryo’s, mini-kooien en Grape-agar mini-Petri schaaltjes. De platen worden in een vochtige kamer geplaatst (standaard Petri schaaltje met absorberende papier schijf verzadigd met water) om uitdroging te voorkomen.  Een kleine hoeveelheid gist pasta werd geplaatst in het midden van elke druif-agar plaat.  B) Maak het deksel van de embryo plaathouder (rood) los en leg een bereide plaat, gist zijde naar boven.  (C) Breng het kruis over naar de embryo kooi en plaats onmiddellijk een Petri schaaltje om de vliegen naar binnen te houden.  (D) Verwijder het deksel snel en draai de embryo kooi om, zodat de contacten druif-agar plaat worden geopend.  Inincuberen voor 24-48 h, dagelijks inspecteren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 6 : Embryonale ontwikkeling op druiven-agar-platen. (A) wild type embryo’s afgezet op de Grape-agar mini-Petri schaaltjes worden geteld onder een ontleed Microscoop. Houd de platen in de vochtige kamer wanneer u ze niet visualiseert en Vermijd direct licht om uitdroging te voorkomen.  B) druiven-agar-platen worden in een vochtige kamer gehouden en er worden uitgebroed embryo’s van wild type geregistreerd.  Deze foto toont drie wild type L1 larven die ontwikkeld zijn uit embryo’s getoond in A.  C) voorbeelden van geregistreerde aantallen embryo’s (dag 1) en L1 larven (dag 2) voor de twee in Figuur 5getoonde plaatjes.  Het “verwachte aantal” voor de nulhypothese wordt bepaald door het aantal embryo’s dat werd uitgebroed en L1 larven werd op het moment van overdracht naar de voedsel flacon (tabel hieronder).  Voor wild type vliegen komen bijna alle embryo’s om en ontwikkelen ze tot L1 larven.  Dit is mogelijk niet het geval voor andere genetische achtergronden en deze methode wordt gebruikt om deze verschillen in levensvatbaarheid te bepalen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 7 : Het overdragen van larven.  A) na het opnemen van L1-tellingen worden de Grape-agar-schijven zorgvuldig verwijderd uit de Petri schaal met behulp van een schone (ethanol-gewiste) spatel (B,C) en overgebracht L1 side-Down om contact op te nemen met het voedsel in de injectieflacons, zoals weergegeven in D.  E) de lege Petri schaal wordt zorgvuldig geïnspecteerd om eventuele larven op te sporen.  Als larvaee in leven blijft en kan worden overgebracht naar de voedsel flacon, doe dat dan zorgvuldig en onmiddellijk (F).  Als larven achterblijven dood zijn of niet kunnen worden overgebracht, Noteer dit feit om het “verwachte aantal” voor latere berekeningen te corrigeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 8 : L2 larven maken hun weg naar het voedsel. Zie spleten en groeven tussen de druif-agar-schijf en het blauwe voedsel.  Stel een schema op om de flesjes dagelijks te observeren, bij voorkeur op hetzelfde tijdstip van de dag. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 9 : Volwassen opkomst. A) L3 larven maken hun weg uit het voedsel om pupae te worden.  (B) volwassenen beginnen op dag 11 te verschijnen.  Stel een schema in om de flesjes dagelijks te observeren, bij voorkeur op hetzelfde tijdstip van de dag en noteer zorgvuldig uw waarnemingen.  Stop met tellen als alle poppen zijn ontstaan (Tel lege poppen-gevallen) en Vermijd het tellen van de volgende generatie vliegen door het experiment op dag 15 te stoppen en de dode poppen te tellen (zwart/gedroogd poppen).  Mutanten met langere levenscycli hebben mogelijk langer tijd nodig, wat empirisch moet worden bepaald. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Aanvullende cijfers. Klik hier om deze bestanden te downloaden.   Aanvullende materialen. Klik hier om deze bestanden te downloaden.  

Discussion

Samengevat, deze methode biedt een nauwkeurige en eenvoudige beoordeling van de levensvatbaarheid in Drosophila. Het volledige protocol duurt ongeveer 14 dagen om te voltooien. De procedure vereist geen deskundige technische vaardigheden; de juiste timing, een schema van dagelijkse waarnemingen en een zorgvuldige agar-overdracht zijn echter belangrijk voor de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid.

Naast de plaatsing van de druif-agar schijf embryo-zijde naar beneden in de voedsel flacon, is een andere cruciale stap in de procedure het overbrengen van de agar-schijf naar een voedings flacon voor levensmiddelen, niet later dan 48 uur na het verwijderen van de Grape agar plaat uit de embryo collectie mini kooien. Het overbrengen van de agar na 48 h resulteerde in het verlies van embryo en larven, waarschijnlijk als gevolg van uitdroging van de agar-schijf. Om L2/L3-overgangen te tellen, moet de plaat voor 72 uur inbroed. Als deze fase van cruciaal belang is, moeten druiven agarplaten dikker worden gegoten en moet een vochtige kamer worden gebruikt om uitdroging te voorkomen. De kruisen werden opgezet in kooien voor het verzamelen van embryo’s die plaats bieden aan 35 mm platen; echter, deze procedure kan worden uitgevoerd met behulp van grotere embryo kooien ook, zoals een die geschikt is voor 60 mm of 100 mm Petri platen.  Voedsel flessen moeten dan groot genoeg zijn om die maten te kunnen onderbrengen.

Er zijn stappen die kunnen worden toegevoegd aan dit protocol. Zoals hierboven vermeld, zijn L2/L3-overgangen uitdagend om op platen te kwantificeren vanwege de benodigde tijd en de mogelijke uitdroging van de agar. Daarnaast worden larven zeer mobiel op het oppervlak van de agar, wat een uitdaging is om ze nauwkeurig te tellen. Het plaatsen van de platen in de koelkast voor 30 min of het toevoegen van een paar druppels van een milde verdoving (lidocaïne oplossing) op het oppervlak van de agar vóór het tellen van L2/L3 larven kan helpen vertragen hun bewegingen om ze nauwkeuriger te tellen.  Een voorbehoud van deze wijzigingen is dat ze variabelen kunnen introduceren (koude gevoeligheid, verdoving gevoeligheid) en de levensvatbaarheid resultaten gevonden.  Zelfs zonder deze stappen, door het gebruik van gekleurd voedsel, onderzoekers kunnen zwerven L3s/prepupae als ze zich vestigen op de zijkant van de voedsel flesjes te initiëren pupation. Een beperking van deze methode is dat de volwassenen die in de kruisen worden gebruikt, moeten overleven met CO2 voor fenotypen om de kruisen in de kooien voor embryo winning op te zetten. DM ime4 homozygoot Mutant mannetjes niet goed herstellen en sterven een paar uur na het wakker worden van co2 behandeling.  Andere methoden om te immobiliseren volwassenen voor het sorteren kan worden verkend, zoals het plaatsen van flesjes in de koelkast voor een paar minuten en vervolgens het overbrengen van flesjes naar gemalen ijs om langzame beweging en snel en efficiënt sorteren.

Afgezien van het vergelijken van allel sterke punten en hun effecten op de levensvatbaarheid, deze methode kan worden gebruikt om gevoeligheid of weerstand tegen gedefinieerde farmaceutische verbindingenscherm. In tegenstelling tot andere methoden die scherm samengestelde toxiciteit in celcultuur15,16,17,18, deze methode maakt gebruik van hele organismen, het beoordelen van de ontwikkelingseffecten gemakkelijker te analyseren. Kortom, het gebruik van dit protocol en de daarin aangebrachte wijzigingen, zal toelaten om allel sterktes te meten, evenals de effecten van omgevingsfactoren en chemische verbindingen op Drosophila levensvatbaarheid, fecondity, vruchtbaarheid, levensduur, en duur van ontwikkelingscyclus.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ons werk wordt gefinancierd door NIH 1R15GM1131-01 naar CFH en NIH PA-12-149 naar CFH.

Materials

Antimold additive Carolina
Beaker Fisher Scentific S76100J Beaker
Benchmark scientific digital hotplate The Lab Depot H3760H Hot plate
Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food Any tap water filtration system
CO2 pistol or FlyNap Carolina Anesthetic to sort/count adult flies
Dissecting microscope/stereoscope Amscope SM-1TSZ-V203 Dissecting microscope
Drosophila culture vials and stoppers Carolina 173120 Food vials for growing Drosophila
Embryo collection mini cage Genesee Scientific 59-105 chamber used to gather embryos
Erlenmeyer flask Sigma-Aldrich 70980 Erlenmeyer flask
Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue Carolina https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr
Grape agar Genesee Scientific 47-102 Media used for agar plates
Instant fly flood Carolina 173210 Blue media for food vials
Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation
Metal spatula (small) Carolina
Microwave Any To cook grape agar
Petri dish Kord-Valmark 2901 Petri dish for grape agar
Stir bar The Lab Depot 58948-981-EA Magnetic stir bar
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hartung, E. W. Some observations on the larval growth rate and viability of two tumor strains of Drosophila melanogaster. Science. 107 (2777), 296-297 (1948).
  2. Moree, R., King, J. R. Experimental Studies on Relative Viability in Drosophila Melanogaster. Génétique. 46 (12), 1732-1752 (1961).
  3. Da Costa, M. V. Viability of F1 and F2 generations of crossed Drosophila and Oregon previously adapted to 2 different nutrient media. Comptes rendus de l’Académie des Sciences. 242 (1), 177-180 (1956).
  4. Garcia-Dorado, A., Caballero, A. The mutational rate of Drosophila viability decline: tinkering with old data. Genome Research. 8 (2), 99-105 (2002).
  5. Lence, T., et al. m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila. Nature. 540 (7632), 304-318 (2016).
  6. Haussmann, I. U., et al. m(6)A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination. Nature. 54 (7632), 301-304 (2016).
  7. Stockwer, H., Gallant, P. Getting started: An overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
  8. Hales, K. G., et al. Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System. Génétique. 201 (3), 815-842 (2015).
  9. Gardner, M., et al. Genetic Variation for Preadult Viability in Drosophila melanogaster. Evolution. 55 (8), 1609-1620 (2001).
  10. Hongay, C. F., Orr-Weaver, T. L. Drosophila Inducer of MEiosis 4 (IME4) is required for Notch signaling during oogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14855-14860 (2011).
  11. Zhong, S., et al. MTA Is an Arabidopsis Messenger RNA Adenosine Methylase and Interacts with a Homolog of a Sex-Specific Splicing Factor. The Plant Cell. 5, 1278-1288 (2008).
  12. Wang, Y., et al. N6-methyladenosine modification destabilizes developmental regulators in embryonic stem cells. Nature Cell Biology. 16, 191-198 (2014).
  13. Hsu, P. J., Shi, H., He, C. Epitranscriptomics influence on development and disease. Genome Biology. 18 (197), 1-9 (2017).
  14. Kan, L., et al. The m6A pathway facilitates sex determination in Drosophila. Nature Communications. 8, 1-16 (2017).
  15. Senkowski, W., et al. Three-Dimensional Cell Culture-Based Screening Identifies the Anthelmintic Drug Nitazoxanide as a Candidate for Treatment of Colorectal Cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1504-1516 (2015).
  16. Ramasamy, S., Bennet, D., Kim, S. Drug and bioactive molecule screening based on a bioelectrical impedance cell culture platform. International Journal of Nanomedicine. 9, 5789-5809 (2014).
  17. Weltin, A., et al. Cell culture monitoring for drug screening and cancer research: a transparent, microfluidic, multi-sensor microsystem. Lab on a Chip. 14 (1), 138-146 (2014).
  18. Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).

Tags

Drosophila MelanogasterViability AssayEmbryo To AdultSimplicityAccuracyGrape AgarYeast PasteEmbryo CollectionHatched EmbryosL1 LarvaeL2 LarvaeL3 LarvaePupaeAdult DrosophilaChi-square AnalysisNull Hypothesis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Rockwell, A. L., Beaver, I., Hongay, C. F. A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster‘s Viability from Embryo to Adult. J. Vis. Exp. (150), e59996, doi:10.3791/59996 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image