Monitoraggio delle interazioni GPCR-arresto 1/2 nei sistemi di vita in tempo reale per accelerare la scoperta di farmaci
Summary
Le interazioni di GPCR-z-arrestin sono un campo emergente nella scoperta di farmaci GPCR. Metodi accurati, precisi e facili da impostare sono necessari per monitorare tali interazioni nei sistemi viventi. Mostriamo un saggio di complemento strutturale per monitorare le interazioni di GPCR-arresto-arresto in celle viventi in tempo reale, e può essere esteso a qualsiasi GPCR.
Abstract
Le interazioni tra i recettori accoppiati alle proteine G (GLR) e gli arresti z sono processi vitali con implicazioni fisiologiche di grande importanza. Attualmente, la caratterizzazione di nuovi farmaci verso le loro interazioni con gli arresti z e altre proteine citosoliche è estremamente preziosa nel campo della scoperta di farmaci GPCR, in particolare durante lo studio dell’agonismo di parte della GPCR. Qui, mostriamo l’applicazione di un nuovo saggio di complemento strutturale per monitorare con precisione le interazioni recettore-arresto in sistemi viventi in tempo reale. Questo metodo è semplice, preciso e può essere facilmente esteso a qualsiasi GPCR di interesse e ha anche il vantaggio di superare interazioni non specifiche a causa della presenza di un promotore di bassa espressione presente in ogni sistema vettoriale. Questa analisi di complemento strutturale fornisce caratteristiche chiave che consentono un monitoraggio accurato e preciso delle interazioni recettore-z-arrestin, rendendolo adatto nello studio dell’agonismo distorto di qualsiasi sistema GPCR e del GPCR c-terminus ‘phosphorylation diversi codici ‘scritti da diverse chinasi GPCR (GRK) e modifiche post-traduzionali di arrestini che stabilizzano o destabilizzano il complesso recettore-arresto.
Introduction
I GPD rappresentano l’obiettivo di quasi il 35% dei farmaci attuali sul mercato1,2 e una chiara comprensione della loro farmacologia è cruciale nello sviluppo di nuovi farmaci terapeutici3. Uno degli aspetti chiave nella scoperta di farmaci GPCR, in particolare durante lo sviluppo di agonisti di parte è la caratterizzazione di nuovi ligandi verso le interazioni recettore-arresto4 e le interazioni di arresto-arresto con altre proteine citosoliche come come clathrin5.
È stato documentato che la segnalazione dipendente da z-arrestin svolge un ruolo chiave nei disturbi neurologici come il disturbo bipolare, la depressione maggiore e la schizofrenia6 e anche gravi effetti collaterali in alcuni farmaci come la morfina7.
I metodi attuali utilizzati per monitorare queste interazioni di solito non rappresentano livelli endogeni effettivi delle proteine in studio, in alcuni casi mostrano segnale debole, fotosbiancamento e a seconda del GPCR potrebbe essere tecnicamente difficile da impostare8. Questa nuova analisi di complemento strutturale utilizza vettori promotori di bassa espressione per simulare livelli fisiologici endogeni e fornisce un’elevata sensibilità rispetto ai metodi attuali9. Utilizzando questo approccio, è stato possibile caratterizzare facilmente le interazioni di Galanin receptor-z-arrestin11/2 e anche di z-arrestin2-clathrin10. Questa metodologia può essere ampiamente utilizzata per qualsiasi GPCR di particolare interesse in cui gli arresti z svolgono una funzione fisiologica chiave o la loro segnalazione è rilevante in alcune malattie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzando il metodo qui presentato, le interazioni tra qualsiasi GPCR e .-arrestin1 1/2 possono essere monitorate in sistemi viventi in tempo reale utilizzando questo saggio di complemento strutturale GPCR-arresto-arresto. A questo proposito, siamo stati in grado di osservare il reclutamento differenziale di z-arrestin tra le due isoformi z-arrestin dal GLP-1r (Un prototipo di GPCR di classe B), abbiamo anche osservato una dissociazione del complesso recettore-z-arrestin pochi minuti dopo aver raggiunto il massimo segn…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Programma di Ricerca (NRF- 2015M3A9E7029172) della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal Ministero della Scienza, iCT e Pianificazione Futura.
Materials
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
References
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