疾患関連遺伝子の発現を調べるツールとしてのタウ小細胞局在の変調
Summary
タウは、細胞質に存在する神経タンパク質であり、そこで微小管を結合し、核の中で、アルツハイマー病関連遺伝子の変調を含む非伝統的な機能を発揮する。ここでは、細胞質タウからの干渉を排除しながら核タウの機能を調べる方法について述べる。
Abstract
タウは、ニューロンで発現される微小管結合タンパク質であり、その主な既知の機能は、細胞骨格安定性の維持に関連している。しかし、最近の証拠は、タウがDNA保護に関与する核を含む他の細胞内コンパートメントにも存在することを示し、rRNA転写において、レトロトランスポゾンの移動性および構造組織において核小体。我々は最近、核タウがVGluT1遺伝子の発現に関与していることを実証し、アルツハイマー病の初期段階におけるグルタミン酸放出の病理学的増加を説明できる分子機構を示唆している。最近まで、標的遺伝子の発現を調節する核タウの関与は、細胞質タウの寄与または他の効果の排除を妨げた技術的な制限のために比較的不確実であいまいであった核タウとは関係のない下流要因この不確実性を克服するために、核タウタンパク質によって特異的に変調された標的遺伝子の発現を研究する方法を開発しました。我々は、局在シグナルと細胞下分画の使用を結合するプロトコルを採用し、細胞質タウ分子からの干渉を排除することを可能にした。最も顕著なのは、プロトコルは簡単であり、他の細胞型および細胞状態におけるタウの核機能を研究するために広く適用可能である古典的で信頼できる方法で構成されている。
Introduction
核内のタウタンパク質の機能は、核酸1、2、3、4、5、6と密接に関連していることが示されているように、近年大きな関心を集めている。実際、最近のゲノムワイド研究では、タウが生体内7で原性およびインタージェニックDNA配列に結合することを実証した。ヌクレオラー組織における役割は、8、9、10、11が示唆されている。さらに、タウは酸化および高熱ストレス5、10、12、13からのDNA保護に関与することが提案されているのに対し、変異タウは染色体不安定性およびアヌプロイディ14、15、16に関連している。
これまで、核区画におけるタウの機能を研究する上での課題は、細胞質タウの寄与から核タウの具体的な寄与を解剖する難しさのためにほとんど未解決のままでした。さらに、核区画内のタウ分子に起因する機能は、これまで、核タウタンパク質の直接的な関与の明確な実証を欠いているため、相関に過ぎない。実際、レトロトランスポゾンの移動性またはrRNA転写またはDNA保護11、12、17、18、19におけるタウの関与は、細胞質タウの寄与または核タウに関連しない他の下流因子の影響によっても説明され得る。
ここでは、核局在化(NLS)または核輸出信号(NES)でタグ付けされたタウコンストラクト0N4Rの使用と組み合わせて核コンパートメントを分離する古典的な手順を利用して、この問題を解決する方法を提供します。このアプローチは、細胞質コンパートメントからのタウ分子の波及による可能なアーティファクトに関連する複雑な問題を排除します。さらに、タウNLSおよびタウファミコン構築物は、それぞれ核コンパートメントからのタウ分子の濃縮または排除を誘導し、特定の機能における核タウ分子の関与に対する正および負の制御を提供する。このプロトコルは技術的に容易であり、タウ発現20、21を再活性化する癌細胞などの他の細胞型におけるタウの核機能を研究するために広く適用可能な古典的で信頼性の高い方法で構成されている。さらに、異なる区画に関連する生物学的機能を解剖するために、細胞質と核の両方に存在する他のタンパク質にも適用され得る。
Protocol
1. 細胞培養 培養SH-SY5Y細胞(ヒト神経芽細胞腫細胞株、CRL-2266)を完全培地(ダルベッコの改変イーグル培地:栄養混合物F12[DMEM/F-12]10%胎児ウシ血清[FBS]、2mM L-グルタミン、100U/mLペニシリンおよび100μ細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュベーターで維持する。10cmプレートで細胞を成長させ、コンフルエントになると分割します。 2. 細胞分化 SH-SY5Y細胞を分…
Representative Results
細胞質タウタンパク質の寄与を避ける遺伝子発現における核タウの影響を解剖するために用いられる戦略を図1に示した。簡単に言えば、NLSまたはNESでタグ付けされたタウタンパク質は、それぞれ核コンパートメントに蓄積されるか、または核コンパートメントから除外されます。このアンバランスの機能効果は、VGluT1遺伝子の産物として測定さ…
Discussion
核タウタンパク質が遺伝子発現に及ぼす影響を測定する方法について述べたい。このプロトコルを使用すると、細胞質タウの寄与は強く制限される。このプロトコルの重要なステップは、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞の分化、細胞内分画および核コンパートメントにおけるタウタンパク質の局在化である。
まず、代表結果セクションに示すように、RAおよびBDNFを添加する?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、スクオラ・ノーマル・スペリオーレ(SNS14_B_DIPRIMIO;)からの助成金によって支えられた。SNS16_B_DIPRIMIO)。
Materials
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml, 100ml |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
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Citer Cet Article
Siano, G., Caiazza, M. C., Varisco, M., Calvello, M., Quercioli, V., Cattaneo, A., Di Primio, C. Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes. J. Vis. Exp. (154), e59988, doi:10.3791/59988 (2019).